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1、ABI3100简介 及 其常见问题解析,姜艳艳2007.3.9,主要内容,ABI遗传分析仪简介ABI3100相关简介 ABI 3100构造及毛细管工作原理 数据收集软件的简介 数据分析软件的简介常见问题解析,一.ABI遗传分析仪系列 ABI测序仪和遗传分析仪系列：377 DNA 测序仪,所采用的是板胶最多可同时检测96个样品，要人工手动上样。采用Genescan和Genotyper进行分析。,310遗传分析仪,采用一道的毛细管进行电泳。一支注射器注胶不能使用96孔板,使用48或96孔的模块，0.5ml的离心管上样。所使用的软件及设置与377比较相像。,3100和 3100Avant基因分析仪,
2、3100为16道毛细管3100Avant为4道毛细管使用96孔板或384孔板进行电泳使用注射器将胶注入毛细管，且有两支注射器,3130 和 3130 xl 基因分析仪,3130为四道，3130 xl为16道。从胶瓶中自动吸胶注入毛细管。软件方面与3100基本相同。,3730 和 3730 xl 基因分析仪,3730为48道毛细管3730XL为96道毛细管的其他与3130基本相同,主要性能参数：,二.ABI 3100构造及毛细管工作原理,1.结构图,250l,此图表示的是：气泡没有排出通道。,注意96孔板的使用。3100是16道的，每个run 使用两排孔。若是4道的则是每个run 4孔，注意与样
3、品名的对应。310 是单道的毛细管，不能使用96孔板，而是使用0.5ml 的离心管上样。,阳极有电极插在buffer中,阴极没有电极，而是在毛细管外包裹着一层金属，插在buffer中。,与3100不同，310在毛细管旁边有一根金属电极插在buffer中。,2.毛细管工作原理毛细管两端：,电渗流：pH大于6时，石英带负电荷，熔融的石英毛细管内层带负电，来自毛细管内的溶液的正电荷产生电渗流，沿负电荷的毛细管壁形成双层，在电场作用下，双层中的阳离子向阴极移动，带动可溶分子向同一方向移动。为保证DNA片段分离的重复性，必须包埋毛细管内壁以除去电渗流，ABI3100采用能进行DNA分离的POP-4或PO
4、P-6胶线性包埋毛细管内壁，阻止电渗流，使DNA从阴极到阳极没有液体的流动。毛细管的包埋使之随着时间而性能有所降低，影响使用寿命。,电泳：,检测：一束激光被分成两束从毛细管的两侧同时照亮16根毛细管，当DNA片段经过检测室时，所带荧光染料被激发，荧光被检测到，形成胶图。,三.数据收集软件的简介1.开关机器顺序：电脑，3100机器，收集软件（关机相反）,2.空间校正空间校正表明在CCD上呈现每一根毛细管发出荧光的正确位置，而不反应毛细管的任何信息。更换毛细管，毛细管的被拆卸安装后时要进行空间校正。,3.光谱校正 是为了校正荧光染料发射光谱的重叠，可以消除不同荧光染料间的相互影响。以下情况必需做校
5、正：机器使用了新的dye set，激光器或CCD更换，结果不好有 pull up，pull down的峰。,进行光谱校正遵循以下步骤新建Pvrotocol,新建plate,注意：进行光谱校正时应注意，4道的毛细管和16道甚至更多道的毛细管在检测灵敏度上明显不同，毛细管少灵敏度会明显高一些，这里忽略毛细管使用次数的影响。,校正不好的实例：,1.软件提示：Insufficient number of dye spectra detected!Check raw data.表现：（1）,实际原因：泳道没有收集到信号，即没有检测到目的峰，或目的峰信号过低，低于750rfu。解决方案：如有必要重新校正则
6、减少与甲酰胺的比例，或增大进样时间。,（2）,实际原因：引物峰过高，检测范围包括引物峰部分。解决方案：调整检测范围到引物峰之后，包括所有目的峰。,2.软件提示：Saturated data detected.Calibration failed.表现：,实际原因：气泡引起的峰使信号达到饱和，显示不通过。解决方案：尽量保证胶及通道中没有气泡。（下图是放大图）,3.软件提示：Bad dye order detected.表现：,实际原因：引物峰过高，检测范围包括引物峰部分。解决方案：调整检测范围到引物峰之后，包括所有目的峰。,4.软件提示：Failed quality check:q=0.9380
7、7 is less than minQ threshold(0.95000)表现：,实际原因：各颜色之间引起的put up 和put down 峰导致Q值低于设定值。解决方案：权宜之计是降低Q值设定值，彻底解决就是重新生产matrix。,4.检测样品 目前检测样品是marker0.2l，上样量1.0l，总体积10l 样品的准备：甲酰胺与marker混合均匀分装，加入样品后振荡，离心，95变性5min，冰浴3min，离心，上样。,5.结果的存储先在“我的电脑”的E盘上建一个文件夹用于储存结果，在数据收集软件中有 可以进行设定。,结果的重新导出：结果可以重新导出，或将所需要的部分结果重新导出到指定
8、文件夹。,6.手动控制,注意：手动控制oven时要“send”两次，一次设定温度一次打开oven。,四.数据分析软件的简介,应用GeneMapper进行数据的分析，下面进行简单的介绍。1.Panel及bin的导入,2.分析数据添加要分析的文件夹：,panel,Size standard,Analysis method,分析后如果如下图所示：不通过，查找原因。,查看原始数据：,查看内标：,结果所得图形：,分析工具栏：,常见问题的解析,1.所有毛细管没有数据 原因：毛细管或block通路中有气泡 没有样品进入 自动进样器不在正确位置，使毛细管头吸入气泡或接触不到样品 措施：重新正确上样，排气泡，拆
9、毛细管清洗block，syring，更换胶,2.个别毛细管无信号原因：自动进样器不在正确位置（用20l 样品试验）样品管是中空的（离心）毛细管有弯曲或有损坏（更换毛细管）,3.信号过饱和原因：上样量过大（稀释样品，减少进样时间）,4.信号过低表现为信号很弱，内标只有几十rfu。原因：甲酰胺质量不高 使用的水中盐离子浓度过高（更换超纯水）没有足够的样品（增加上样量，校正自动进样器）样品稀释倍数过大 混合的不充分（充分混合，离心）自动进样器不在最佳位置,5.基线不平，峰形明显异常原因：胶中可能有污染物（清洗block，syring，更换胶）胶中有结晶或沉淀物（将胶在室温放置30min使之达到室温，
10、旋 动使沉淀物溶解）光谱校正的不好,6.信号凌乱，有倒峰原因：所选的dye set不适合 光谱校正的不好,7.无电流或电流异常原因：使用的水质量不好（更换超纯水）buffer槽中是水或 buffer稀释的倍数不对 阳极没有足够的buffer block或毛细管中有气泡（排气泡）胶已失效 整个体系中有泄漏的地方,8.小于100 runs毛细管检测结果不好原因：样品本身不好 甲酰胺质量不好 buffer稀释的倍数不对9.检测的结果异常，移动的快或慢原因：注射器中有水导致胶被稀释 block或胶中有大气泡 整个体系中有泄漏的地方 甲酰胺的质量不好,10.有一根毛细管电泳时背景有荧光，导致基线不平，影
11、响结果。,原因：毛细管中有污染物，会随电泳次数增多逐渐消失。处理办法：不加甲酰胺，每次加10l 的蒸馏水，电泳几次。,11.每次电泳时并不是全部泳道信号都很好 信号弱或无信号的泳道主要集中在两端,解决方法：换成20l 体系试试，调整自动进样器尤其是Z轴。连续多次上样看是否是某根固定毛细管，或者是毛细管有题。或许与所用的96孔板有关，更换96孔板。,12.泳道中间基线明显形成一个台阶,说明：属于正常现象。可能是样品中有一些物质导致的，与样品的纯度有关，但并不影响判型。分析样品是会计算调整基线。,13.电泳导致大片段峰形变宽,说明：属于正常现象，是电泳的一个特点。与电泳时片段大小有关，随着时间的推
12、移片段越来越大，所形成的峰变宽。,注：电泳时胶图,注：分析时图像,14.电泳时易出现尖锐的四种颜色都有的峰（多显示为红色）,说明：胶中有气泡，离子，杂质颗粒或其他有机物不透光，发生全反射 导致的。解决方案：灌胶前放置室内半小时平衡室温，离心，注意排净气泡，注 意环境的洁净程度，注意操作，以减少杂质进入。,15.电泳时出现目的片断以外的其他杂峰,原因：主要原因是甲酰胺质量不好，或者是甲酰胺长期在4度放置有降解。解决方案：更换质量好的甲酰胺。（确定不是扩增产物。）,16.出现电泳峰,说明：所出现的尖锐的小峰实际上是四种颜色都有的，位置不固定，杂乱无章，内标中相对明显，影响分析结果。当室温过高时明显
13、会增多，可能是胶中有气泡，受热膨胀，易形成。严重影响分析结果的建议重新电泳。,16.其他常见的电泳不好的现象,说明：内标峰值很低，样品峰值低不能作为扩增不好的依据。需要重新上样以 确定原因。,说明：内标并不均匀，大片段明显变低，可见是电泳结果不好，样品的峰 形不能作为扩增好坏的依据，需要重新上样来确定。,说明：可见所有峰的峰形异常，不能正确进行分型，是电泳异常的表现，需重 新上样。,说明：变性不完全现象。更换质量好的甲酰胺，在上样前变性95C 3min,说明：如果校正时跑出如图的峰型，是电泳现象，与产品质量无关。更换质量好的甲酰胺，重新进行校正。,说明：上图现象是电泳中出现的现象，在校正正常且
14、多数通过情况下，更换质量好的甲酰胺，上样前变性，重新电泳。与产品质量无关,总体说明：检测结果不好时，对照现象查找原因，主要要注意：使用超纯水 有足够的buffer，且稀释倍数正确 保证block通路中没有气泡，如需要请仪器负责人解决 加入适量样品如要加微量则有必要稀释，进样时间要适当，如不能更改则调整上样量，使峰高在1000-3000 rfu 左右。使用96孔板上样时如样品太多又复杂则应事先写好记录，加样后振荡，离心 变性后立即冰浴3min 注意毛细管的使用次数（在instrument protocol处可见），注意毛细管不要脱离buffer超过30min 如有离子影响结果，可用水上样试一次,其它注意事项：16道毛细管每个run约用胶50l，注意在整板上样时查看胶够不够。做阳性对照和阴性对照。如所提的DNA浓度大，做PCR时适量少加入模板，防止产物量过大影响电泳。每个run加ladder用于分析时校正bin。实验进行过程中不要一陈不变的遵循操作手册，而是要观察结果，调整内标及ladder的使用量。（内标高度控制在200 rfu左右，ladder 控制在和内标相当的高度）,谢谢大家,
