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1、肺炎链球菌候选蛋白疫苗ClpP的保守性的论文肺炎链球菌候选蛋白疫苗ClpP的保守性的论文 【摘要】 目的: 评价酪蛋白裂解酶p6.0 l，dntp2.4 l，p13 l，p23 l，spn dna 1.5 l，la taq 0.4 l. 在pcr仪上按下列条件进行扩增：95预热5 min后反应30个周期：94 1 min，53 1 min，72 1 min. 末轮后72延伸 5 min. 取5 l反应产物置10 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定后，dna胶回收试剂盒回收pcr产物. 1.2.2ta克隆载体的构建与鉴定将回收纯化的12个pcr产物克隆至pmd18t载体，转入dh5感受态细胞，在amp+l
2、b平板上培养得到多个阳性克隆，单个阳性克隆细菌经增菌后进行质粒抽提后双酶切鉴定，并将质粒送往重庆医科大学感染实验室做双向测序. 1.2.3序列比对与氨基酸序列预测利用dnassist软件，将12个重组克隆质粒双向测序的结果及预测的氨基酸序列与genbank数据库对已公布的tigr4 spn全基因组序列进行相似性分析. 1.2.4抗原表位预测用抗原表位预测工具antigenic predicted antigenic peptides（ a href=http:/bio.dfci.harvard.edu/tools/）分析不同血清型spn target=_blank clpp蛋白的抗原表位及其氨
3、基酸组成. http:/bio.dfci.harvard.edu/tools/）分析不同血清型spn clpp蛋白的抗原表位及其氨基酸组成. 1.2.5petclpp重组载体的诱导表达及纯化原核表达系统pet32a/clppe.coli bl21在终浓度1 mmol/l iptg，37，250 r/min条件下诱导目的重组蛋白clpp的表达. 收集的菌体超声波碎菌后，采用ninta柱纯化目的蛋白，以sdspage和biorad凝胶图像分析系统检查目的重组蛋白表达与提纯效果. 将透析除盐的纯化蛋白溶液经bradford法定量后备用. 1.2.6anticlpp抗血清的制备稀释后重组clpp蛋白溶
4、液与等体积的cfa或ifa充分混匀成乳状，在小鼠腹腔下接种制备好的抗原蛋白. 初次免疫时小鼠接受含200 l的cfa与重组蛋白混合物；小鼠再次与末次免疫时接受200 l的ifa与重组蛋白混合物. 小鼠经3次免疫后，分离小鼠血清，并用elisa法测其anticlpp抗体效价. 1.2.7estern blot检测将12株spn在c+y培养基中增菌至对数生长中后期（a620 nm 0.50.6左右），各取2 ml菌液离心取沉淀. 沉淀用pbs洗3次，用1上样buffer处理后，于100水浴5 min. 全菌裂解物经sdspage电泳分离后转膜. 以anticlpp多克隆抗体为一抗（1400)，羊抗
5、鼠hrpigg为二抗（15000），dab为显色底物，estern blot检测菌体中clpp蛋白的表达，以金黄色葡萄球菌作为对照. 2结果 2.1目的基因pcr产物12株细菌的pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后，可见清晰的扩增条带，产量高，所有pcr产物的分子大小一致，都位于600 bp左右. 2.2ta克隆载体的构建与鉴定将12个重组克隆质粒双酶切后，经10 g/l的琼脂糖凝胶电泳，于期望位置上出现目的条带，证明clpp开放读码框架正确克隆入pmd18t载体，同时菌落pcr结果也证明基因克隆正确. 2.3测序结果与序列比对不同株的clpp基因编码区大小与tigr4菌株中clpp基因一样，均为59
6、1 bp，起始密码子为atg，终止密码子为taa，编码196个氨基酸，基因序列一致性超过99%. 由于遗传密码子的简并性，预测的氨基酸序列一致性则为99.5%以上. 经生物学信息软件分析结果显示，serotype 4，5，6b 三菌株clpp氨基酸序列与tigr4菌株clpp氨基酸序列仅存在着一个氨基酸的差异，serotype 1 spn与tigr4菌株clpp氨基酸序列仅存在着两个氨基酸的差异，其余血清型与tigr4菌株clpp氨基酸序列完全一致. 2.4抗原表位分析结果12株spn clpp蛋白的抗原表位数目相同（分别含7个抗原表位）并且氨基酸组成及分布完全一致. 2.5融合蛋白及其ant
7、iclpp抗体效价转化菌经iptg诱导后，较未诱导菌有一条明显增粗的蛋白条带，mr约为42103左右，与期望值相符合（clpp蛋白约为mr 21103，再加上mr 21103左右的硫氧还蛋白）. 蛋白溶液经镍离子柱亲和层析后透析，sdspage证明纯化产物为单一蛋白，纯度达90%. 该蛋白免疫小鼠后用elisa法测得的血清效价为168 000（图3）. 2.6clpp蛋白的表达spn全菌裂解物经电泳分离后，与制备的anticlpp血清反应，12型spn全菌裂解物mr均在21103的位置出现特异性反应条带，而阴性对照未见反应条带出现. 提示不同血清型spn中均有clpp蛋白抗原的表达. 3讨论
8、蛋白疫苗是spn的第三代疫苗. 目前认为理想的spn蛋白质疫苗的标准应包括:能在细胞壁表达或者以分泌方式表达、在人体内抗原性高、能诱导杀菌的抗体和具有高度的保守性. 随着基因组学与蛋白组学的发展，spn毒力相关蛋白候选疫苗不断地被筛选出来. 但是一些蛋白由于等位基因的变异5-7，针对于该蛋白的抗体升高不能识别其等位基因变异的表达产物，从而不能诱导针对不同血清型菌株广泛的免疫保护. 因此，候选疫苗是否具有诱导高水平、能与不同种类的型或亚型菌株起交*反应的抗体的能力，是很多致力于spn疫苗的专家不断寻找高保守蛋白疫苗的原因8-9. 我们要评价clpp候选蛋白疫苗的价值就应考虑其在不同血清型spn的
9、保守性，并考虑clpp是否在spn菌体中表达. 本研究选用分离自不同标本并且在中国比较常见的1012株不同血清型spn进行研究，结果发现，在12株菌中clpp基因相当保守，其抗原表位氨基酸组成以及分布完全一致，无抗原位点的突变，而且12株spn菌体蛋白中都有clpp蛋白的表达. 我们的结果初步表明：clpp在不同血清型spn中高度保守，在不同型菌体中都有表达. 细胞壁表达的高保守性蛋白是首选的疫苗靶点. 目前研究较多的几个spn蛋白质疫苗如pspa11，pspc6和ply12等，pspa和pspc虽在细胞壁表达，但由于等位基因变异，保守性相对较差；ply虽具有较高的保守性，但在细胞内表达，其抗
10、体难以透过细胞壁与之结合，疫苗保护效果难以得到保证. 而clpp在spn热休克后从细胞内向细胞壁易位3，同时具有高度的保守性，因此它是spn很好的疫苗靶点，将其单独使用或与其他的蛋白疫苗组合使用，可能会使spn蛋白疫苗的研究取得突破性进展，从而为我们自主开发广保护范围的spn疫苗提供理论基础. 另外我们也采用了blast方法分析了spn clpp与邻近种属细菌clpp基因序列的相似性，发现spn clpp与许多其它种属细菌的clpp基因序列具有高度的同源性，比如spn的clpp与唾液酸链球菌clpp的预测氨基酸序列相似程度为87%88%，与无乳链球菌clpp的预测氨基酸序列相似程度为91%92
11、%. clpp可能在这些菌属中存在相同的抗原表位，并可能诱发交*反应，这应该引起注意. 总之，在大规模人类免疫接种前对这类高保守蛋白进行彻底的安全性调查，将是非常必要的.【参考文献】 1 bogaert d, hermans p, adrian pv, et al. pneumococcal vaccines: an update on current strategiesj. vaccine, 2004,22:2209-2220.2 yu ay, houry a. clpp: a distinctive family of cylindrical energydependent serine
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