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1、兽类学报 , 2009 , 29 ( 2) : 227 - 230A cta Theriolog ica S in ica兽类骨骼标本制作新方法 :碱性蛋白酶消化法3武永华杨奇森(中国科学院动物研究所 , 北京 100101 )关键词 : 兽类 ; 骨骼标本制作 ; 碱性蛋白酶消化中图分类号 : Q95 - 342文献标识码 : A文章编号 : 100021050 ( 2009 ) 02 - 0227 - 04M amm a l ian ske le ton spec im en prepa ra t ion u s in g pro teo ly t ic en zym e ( a l2ca
2、 la se) de tergen tWU Yonghua, YAN G Q isen3( Institu te of Z oology, the Ch inese A cadem y of S ciences, B eijing 100101, C h ina)A b stra c t: W e repo rt on an ea sy m e thod to remove mu sc le tissue from the ske leton by a lca la se de tergen t in mamm alian ske le2 ton spec imen p repa ra tio
3、n1 In the p re sent pap e r, using ha re skull sp ecim en as an examp le, we de sc ribe the a lca la se detergen t2 m e thod in deta ils and compa re it w ith o the r m ethod s fo r m amm alian skeleton spec im en p repa ra tion1 In th is m ethod, ha re m us2 cle tissue s a re removed from ske leton
4、 s by a lca la se detergen t1 W ith comm e rc ia l p ro te ina se s, a lca la se ( 214 L , 214 AU / g, No2vozyme s B io techno logy Co1, L td1) , the p roce ss requires around 10 m inu te sske letal simme ring in a 015% so lu tion (V /V )of the alcalase and wa te r under 60 cond ition1 In to ta l, a
5、bout 101 ra t sku ll and 487 ha re skull sp ecim ens are m ade u sing th is m ethod1 Comp a red to o the r traditional m e thods in m amm a lian skeleton spec imen p repa ra tion, the a lca la se detergen t m ethod is safer, mo re effic ient and le ss co stly, and it is a lso su itab le fo r ba tch
6、p roduction of ske le ton sp ecim en1Key word s: A lca la se de te rgen t; M amm a l; Ske le ton sp ec im en p rep a ra tion兽类骨骼标本不但具有展示的功能 , 而且在传统的形态分类中也具有重要的作用 。随着种群遗传 学的发展 , 我们往往希望能从形态和遗传两方面分析种群间的分化 。这就需要有大量的骨骼标本 , 因此 , 骨骼标本的批量制作就显得非常必要 。通常 , 骨骼标本制作的主要环节包括 : 剔除软 组织 , 脱脂和漂白 。其中 , 最为费时费力的环节就是剔除骨骼上的
7、软组织 。在形态学的研究中 , 煮制 法被广 泛 用 于 兽 类 骨 骼 标 本 的 制 作 (徐 文 贤 ,1993; 朱孝荣和袁红花 , 1998; 肖方 , 1999; 刘华 金等 , 2004 ) 。这是因为采用该方法所需的条件很 简单 , 对几个标本来说是经济适用的 ; 然而 , 该方法费时费力并且也无法将微细结构的骨骼清理干 净 。当制作的标本较多时 , 煮制法就难以满足需 要 , 相应地一些新方法就被用来制作骨骼标本 , 一 个可替 代 的 方 法 是 虫 蚀 法 , 皮 蠹 ( H a ll and R u s2 se ll, 1933; Bo re ll, 1938 ) 、面
8、 包 虫 (宋 树 春 和 王峰 , 2001; 邱挺 , 2004; 张成菊和吴毅 , 2005 ) 和 蚂蚁 (陈志等 , 2006 ) 等都不失为一些可用的选择 。虽然采用虫蚀法可以节省人力和时间 , 但会在骨骼表面较均匀地残留一层软组织碎屑 , 并且皮蠹 和蚂蚁的大量获得不太容易 。此外 , 微生物腐蚀法(土埋法 , 水浸法 ) 也可以用来制作骨骼标本 (肖方 , 1999 ) , 但由于该方法会污染环境并且所需时 间久 , 现在已很少使用 。其次 , 四水过硼酸钠 (N aBO3 14H2 O ) 也曾用于 骨 骼 标 本 的 制 作 ( Chapm an and Chapm an,
9、1969 ) , 此方法后经改进 (M cDona ld and V aughan,1999 ) , 其效果类似于上面讲的虫蚀法 。除此 , 商 业洗涤剂也被用来制作骨骼标本 。商业生产的洗涤 剂往往含有一些降解蛋白的酶 , 从而被用来制作骨骼 标 本 ( O ssian, 1970; Mooney et a l1, 1982; 胡 琪和欧阳铭 , 2001 ) 。采用洗涤剂产品制作骨骼标 本的缺点 , 一方面是骨骼软组织残留较多 , 另一方 面是用时较长 。了解当代分子生物学知识的人可能都知道 , 提取 DNA 过程的第一步就是用蛋白酶 K消化去除蛋 白组织 。这为本文尝试采用蛋白酶降解附着
10、在骨骼作者简介 : 武永华 ( 1978 - ) , 男 , 博士研究生 , 主要从事保护遗传学研究 1 E - m a il: wyh781230 ioz1ac1cn收稿日期 : 2008 - 07 - 31;修回日期 : 2008 - 12 - 173 通讯作者 , co rre spond ing au tho r, E - m ail: yangq s ioz1ac1cn上的软组织带来了启发 。在比较了当前市场上多种蛋白酶的成本以及降解蛋白能力等后 , 我们最终选 用碱性蛋白酶用以头骨标本的制作 。在我们所能查阅的文献中 , 碱性蛋白酶还没有被明确提到用于制作骨骼标本 , 故此报道 。
11、体上剥离 , 剔除附着在骨骼上的大块肌肉 , 主要包括下颌骨两侧的肌肉 , 以及眼睛和舌 , 最后把颅腔 中的脑髓用直头镊子由枕骨大孔伸入搅几下便于消化液进入 。( 3 ) 配制消化液 : 将碱性蛋白酶与自来水按 体积比 1 200混合成消化液 。( 4 ) 将预处理过的标本放入搪瓷盘内 , 倒入消化液直至稍稍没过标本 。随后将搪瓷盘放入恒温 水浴箱内 , 注意不要使水浴箱内的水进入搪瓷盘 , 最后盖上水浴箱盖 。( 5 ) 约过 7 8 m in后用直头镊子夹出其中一 个标本 , 初次查看消化的效果 。软组织若有残留则继续消化约到 10 m in再次查看 , 如果附着的软组织 基本都已干净就
12、可以捞出标本 (消化液可反复使 用 5 次以上 ) 。1 材料与方法111 实验材料及试剂 、工具材料 : 仓鼠头 1个 , 三趾跳鼠头 100个 ,塔里木兔头 487个 , 每个标本上均系有竹标签 , 并用铅笔标记野外号 。试剂 及 工 具 : 碱 性 蛋 白 酶( A lca la se 214 L ,酶活力 214 AU / g, 诺维信生物技术有限公司 ) , 自来水 , 竹 标 签 , 牙 刷 , 手 术 刀 ,子 , 弯头镊子 , 恒温水浴箱 。112 实验步骤搪 瓷 盘 ,直 头 镊( 6 ) 在自来水笼头下用牙刷刷洗骨骼 ,弯头镊子掏净脑颅中的脑髓 。并用( 1 ) 在恒温水浴
13、箱中加入纯净水 ,并调节水温至约 60 (碱性蛋白酶水解的最适温度 ) 。( 7 )脱脂 ,漂白 ,晾干头骨 。( 2 )实验材料预处理 :首先将头骨从动物尸图 1不同方法制作的兽类头盖骨标本 1 (A ) 碱性蛋白酶消化法制作的塔里木兔头盖骨侧面 ;(B ) 碱性蛋白酶消化法制作的塔里木兔头盖骨腹面 ; ( C) 手工完成的馆藏草兔头盖骨侧面 ; (D ) 面包虫蚀的三趾跳鼠头盖骨腹面F ig11 The m amm a lian c ran ium sp ec im en s m ade by d ifferen t m e thod s1 (A ) late ra l view of c
14、 ran ium of L epus ya rkandensis m ade by the alca2lase dete rgen t; (B ) ven tra l view of c ran ium of L epus ya rkandensis m ade by the a lca la se de te rgen t; ( C) la te ra l view of cran ium of L epus cap2ensis m ade by the artific ia l m e thod; (D ) ven tra l view of c ran ium of D ipus sag
15、 itta m ade by the de rm e stid m e thod2期武永华等 : 兽类骨骼标本制作新方法 : 碱性蛋白酶消化法229比例配成消化液 , 碱性蛋白酶的工作浓度就为每毫升消化液 01014 AU。在实际操作 中 , 我 们 反复 实 验过不同的浓度 , 浓度太高会浪费试剂并且会损坏骨骼 , 使得骨缝连接处容易分开 。浓度过低又会费时 。1 200的比例虽然不是最优的工作液配比 , 却 是我们多次实验获得的相对好的配比 。不同动物可 能需要不同的工作液配比 , 这需要多次的预实验来确定 。其次 , 消化的温度 。碱性蛋白酶是由选育出的 地衣芽孢杆菌生产得到的 , 该酶
16、的主要有效成分为 枯草杆菌蛋白酶 A , 是一种内切蛋白酶 , 其最适工 作条件为温度 55 70 之间 (取决于底物的类型 ) , 最适温度约 60 , pH 615 815。在实际操 作中温度控制在 55 60 都可以 。最后 , 消化的时间 。本次实验所需的消化时间 约 10 m in左右 。当然 , 消化的时间主要受消化液的 浓度 、消化的温度 、以及消化底物量等的影响 。在前两者一定的情况下 , 消化底物的量应尽可能减 少 , 即尽可能剔除多余的软组织 。因为软组织在骨 骼上的不均匀分布 , 会导致各个部位消化不同步 , 从而可能使得先消化完的部位骨骼容易脱落 , 比如 鼻骨 , 而
17、有些部位却还没消化完 。所以 , 在消化前去除那些大块的软组织会明显提高消化的效率 。至 于如何去除大块的软组织 , 我们可以先用水煮几分 钟 , 然后直接用手术刀或镊子去除 。有时还可以采 用面包虫嗑的方法 。可见将传统方法和酶消化法结 合运用更有效 。另外注意的是 , 在同一批次的样本中 , 应尽量安排同一年龄组的个体 , 因为幼体往往 先于成体消化完全 , 并且骨骼容易从骨缝处分离 , 尤其是枕骨易分离 。本次实验 , 我们用碱性蛋白酶消化法制作野兔 和鼠类的头骨标本 , 取得了很好的效果 。这种酶消化的方法不但可以用于兽类头骨 , 还可以用于兽类 全身骨骼标本的制作 。同样 , 从原理
18、上讲 , 这种方 法可能也适用于两栖爬行以及鸟类骨骼标本的制 作 。另外 , 对制作不同动物骨骼标本所需消化液的 浓度 , 可以在本文 1 /200体积比的基础上进行预实验 , 大型兽类的骨骼需要的酶浓度可能稍高 , 而两 栖爬行或鸟类的骨骼可能要稍低 。需要注意的是 , 这种方法可能会对骨质造成一定的损伤 , 这是因为 骨骼的组成成分也含有一定量的蛋白 , 但这种损伤 需要经过长期的观察才能了解 , 在短期内我们还没有发现相应的损伤 。只要我们在消化之前尽量去除 多余的软组织 , 采用合适的消化液浓度 , 减少消化2 结果我们用该方法共试做了 588 个兽类头骨标本 , 其中包括 1只仓鼠
19、, 100 只野生三趾跳鼠和 487 个 野兔 , 每次实验效果都很稳定 。与其它方法比较 , 碱性蛋白酶消化法的优点在于以下几方面 :第一 , 制作的骨骼标本干净 。消化后软组织残留很少 , 除了一些筋难于消化外 , 其余软组织基本 都可以去除 。并且鼻腔和听泡内手工难以触及的死 角也可以消化干净 。为了对照分析 , 图 1中也包括 了馆藏手工制作的草兔头骨标本和本研究组之前用 面包虫制作的三趾跳鼠头骨标本 。图 1中草兔和跳鼠标本尚未经过脱脂和漂白工序 , 但这不影响我们 的对照效果 , 因为脱脂和漂白不影响残留软组织的 存留 。显而易见的是 , 经碱性蛋白酶消化所得标本 非常干净 , 很
20、少有软组织残留 。第二 , 成本低廉 。碱性蛋白酶 214 kg包装的体积约为 1 200 m l, 市售价为 340 元 , 如果将其与水 配置成体积比为 1 /200的消化液 , 再假定消化液可 反复使用至少 5次 , 则每个兔头骨所分担的碱性蛋 白酶成本约为 0103 元 。另外 , 消化所需设备简单 , 可以灵活选择 。在实际工作中 , 只要能提供酶消化所需温度的装置便可 , 并不限于本次实验所用的恒 温水浴箱 。市场上用于鱼缸的恒温加热棒放入适当 的容器也可以用来提供消化的环境 。第三 , 耗时少 , 效率高 。去除大块软组织后的 头骨消化起来非常省时 , 对于本实验的野兔头骨 ,平
21、均消化时间为 10 15 m in, 只要能够提供足够大 的容器 , 每人每天几乎可以完成上百个头骨标本的 制作 , 而传统的人工方法需要将样本水煮后人工一 点一点去除 , 一个熟练技术工一天最多只能做 5 6个标本 。第四 , 安全性高 。比起其它方法 , 碱性蛋白酶 对人体的伤害非常小 , 并且也不会污染环境 , 废液 容易处理 , 可直接排入地下管道 。酶是蛋白质 , 对 于敏感的人来说吸入酶粉尘或雾滴有可能发生过 敏 , 过长时间接触有可能刺激皮肤 、眼睛和粘膜组织 。在实际操作中 , 只要带上橡胶手套并在通风的 情况下就可以避免它对人体所带来的伤害 。3 讨论首先 , 消化液的工作浓
22、度 。本次实验所用的碱 性蛋白酶原溶液活力单位为每克溶液 214 AU , 该 酶的密度约为每毫升溶液 112 g, 如果以 1 200 的ra tion u sing the enzym e2ac tive de te rgen t techn ique. The A na tom ica lR ecord , 202: 125 - 1291O ssian C R1 19701P rep a ra tion of d isa rticu la ted ske le ton s u sing enzym e2ba sed laund ry“p re2soake rs”1 C opeia , 1
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25、大学学报 , 28 ( 23 ) : 23901胡琪 , 欧阳铭 120011颅骨标本制作一例 1 武汉科技大学学报 (自 然科学版 ) , 24 ( 2 ) : 208 - 2091徐文贤 119931骆 驼 骨 骼 标 本 制 作 方 法 简 介 1 中 国 兽 医 科 技 , 23( 1 ) : 45 - 461的时间 , 就能最小程度地减小酶消化对骨骼的损伤 。致谢 : 在讨论中刘杰对我们提出酶消化法给予了启示 , 北京华章未央科技有限公司的王霞 , 就酶的选 择给予了相应的帮助 , 用于实验的仓鼠样本由熊文华提供 , 冯祚建先生对本文写作给予了指导 ,一并表示感谢 。在此参考文献 :
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