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1、 学 士 学 位 论 文论文题目： 鹅血清及卵黄中IgG的测定 学生姓名： 专业年级： 畜禽生产教育 2004级 指导教师： 职称 目 录题目I摘要及关键词II1 前言12 材料与方法12.1 试验材料12.1.1 试验动物12.1.2 主要试剂12.1.3 仪器与设备22.2 实验方法22.2.1 鹅血清IgG的提取、分离与提纯22.2.2 鼠抗鹅IgG抗体的制备22.2.3 兔抗鹅IgG酶标抗体的制备22.2.4 鹅血清及卵黄参考阴性与参考阳性的选择及制备32.2.5 双抗体夹心ELISA试验各反应条件的确定32.2.6 阳性判定值的确定42.2.7 ELISA检测方法的检验43 结果与讨
2、论53.1 鹅IgG及其抗体制备结果53.2 鼠抗鹅IgG抗体的制备结果63.3 兔抗鹅酶标抗体的检测结果63.4 双抗体夹心ELISA检测方法的建立74 结论9参考文献9致谢11鹅血清及卵黄中IgG的测定 摘要：免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，简称IgG）指具有抗体活性的动物蛋白。在禽类，母代可以通过卵子将自身的免疫球蛋白传递给子代，对子代起到保护作用20。本试验应用ELISA对102枚吉林白鹅种蛋进行检测，检测项目为鹅胚发育过程卵黄中IgG和鹅胚血清中IgG的含量。结果表明，鹅胚血清中和卵黄中IgG含量是，14.5日龄为0.1717g/mL和3967.62g/mL，34.5
3、日龄（出壳3.5天）日龄为1495.6413g/mL和2821.363g/mL。关键词：鹅;免疫球蛋白G;ELISADetection of Goose IgG in serum and egg yolk Abstract:Egg yolk antibody which is a kind of immune globulin in egg yolk is -livitin. It is named immunoglobulin of yolk(IgY) that antibody extracted from egg yolk in immunological domain, for it
4、is difference to IgG extracted from mammal in physical property, chemical property and immunological property. In this researching, IgG in goose serum was extracted with saturated ammonium sulfated method and sephodex-G200, and mouse-anti-goose antibody and rabbit-anti-goose enzyme labelled antibody
5、 was provided with the goose IgG. Then ELISA reaction pacing factors were determined include density and time of antigen covering, reaction of antigen and antibody, and enzyme labelled antibody. At last double antibody sandwich ELISA which can quantitated detecting goose IgG was established after sp
6、ecificity test, reproducibility test and sensitivity test. At present, ELISA was applicated usually in the domain of immunology and biology. And ELISA commercial kit has been produced. It was convenient and reliable detecting means for related research. But ELISA and ELISA kit for goose IgG is not r
7、eported. The aim of this research is to establish ELISA which can detect goose IgG, then offer test facility for correlated research and provide reference for ELISA kit research. Keyword: goose；egg yolk antibody； ELISA1 前 言卵黄抗体即卵黄免疫球蛋白就是卵黄中的卵黄球蛋白，由于其蛋白质的物理化学性质、免疫学性质等方面与哺乳动物免疫球蛋白存在一定差异1，2，所以在免疫学领域把由禽
8、卵黄中获得的抗体称为卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of Yolk，简称IgY)3。IgY的用途是非常广泛、多样的，其中最重要的功能是由母体传递IgY给新生儿提供被动地免疫保护力。IgY普遍存在于鸟类、爬行动物和两栖类，在功能上等价于哺乳动物IgG，但其许多生物学性质仍未被发现。免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是指免疫系统受抗原刺激后,B细胞转化为浆细胞而产生的具有抗体活性,能与相应的抗原发生特异性结合的球蛋白,或指化学结构与抗体相似的球蛋白。它广泛存在于机体的血清、体液及粘膜分泌液中,是构成机体体液免疫的主要物质，免疫球蛋白分为IgG、IgA、IgM、IgD和I
9、gE4，5。禽类已确证的免疫球蛋白有三种：即IgG（IgY）、IgM和IgA6。其中IgG是最主要的免疫球蛋白，约占动物血浆丙种球蛋白的70%，分子量约15万，含糖23%。IgG具有提高免疫力、增强机体抵抗力等作用。目前国内尚没有定量检测鹅IgG的相关报道。本文应用酶联接免疫吸附剂测定法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，简称ELISA)对鹅血清及卵黄中的IgG含量进行了测定，现将结果报告如下。2 材料与方法2.1 试验材料2.1.1 试验动物吉林白鹅种蛋购于吉林省某种鹅场2.1.2 主要试剂磷酸氢二钠 分析纯 北京化工厂磷酸二氢钠 分析纯 北京化工厂牛白蛋
10、白（生化试剂） 分析纯 上海新兴生物有限公司氯化钠 分析纯 北京化工厂饱和硫酸氨SephadexG200 分析纯 北京鼎国生物有限公司辣根过氧化物酶 分析纯 北京鼎国生物有限公司鹅IgG、鼠抗鹅IgG抗体、兔抗鹅IgG酶标抗体为本实验室自制2.1.3 仪器与设备恒温箱、电子天平；40孔聚苯乙烯酶标反应板；XYJ801台式离心机 ；LD42A低速离心机；北京医用离心机厂；磁力搅拌器（781型磁力加热搅拌器）分光光度计751C型；酶联免疫检测仪DG3022型；孵化器；冰箱；酸度计pHS-3C ；ELISA板。2.2 实验方法2.2.1 鹅血清IgG的提取取健康吉林白鹅的混合血清20mL，加生理盐水
11、20mL，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液10mL，使成为20（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置30min；3000rpm离心20min，弃沉淀；在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液30 mL，使成50（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置30 min；离心20 min，弃去上清；于沉淀中加入20 mL生理盐水，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液10 mL，使成33（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置30 min；3000 rpm离心20 min，弃去上清，以除去白蛋白，重复3次；用10mL生理盐水溶解沉淀，装入透析袋；透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4透析
12、24h，中间换液数次，直至完全除去SO42或NH4离心去沉淀；离心去沉淀（去除杂质蛋白）上清液即为粗提的IgG；将G200凝胶活化、浮选、装柱，以0.01molL pH 7.4 PBS液洗脱、平衡。并向其中加入上一步中所提取的粗提的IgG样本，以PBS液洗脱，收集第二蛋白洗脱峰，浓缩即为精提IgG。2.2.2 鹅血清及卵黄参考阴性与参考阳性的选择及制备2.2.2.1 鹅血清参考阴性的制备取吉林白鹅血清5份充分混合（4ml/份），取此混合液20mL，加生理盐水20mL，充分混合，逐滴加入35饱和硫酸铵，边加边搅拌，混合均匀后静置30分钟，然后3000转/分钟离心20分钟，弃去沉淀，上清装入透析袋
13、，常水流水透析12小时，然后生理盐水透析24小时，其间换液数次。最后将提取液浓缩至原体积，重复3次。分装冻存于20冰箱。2.2.2.2 鹅血清参考阳性的制备 取吉林白鹅血清5分，混合（该血清取自制备参考阴性血清的吉林白鹅），分装冻存于20冰箱。2.2.2.3 鹅卵黄参考阴性的制备无菌取卵黄5份，充分混合，取此混合液20mL，蒸馏水10倍稀释，用稀酸调节至PH5.2，8 000转/分钟离心。蒸馏水稀释沉淀至卵黄原体积，将卵黄、生理盐水、氯仿按1:2:2混合，混匀后置室温2h，2 000克离心力离心20min，分成三相，油相、水相、固相，弃去水相，然后将油相与固相充分混合，室温下挥发掉氯仿，蒸馏水
14、稀释至原体积。蒸馏水稀释7倍，分装冻存与-20冰箱中8。2.2.2.4 鹅卵黄参考阳性的制备无菌取卵黄5份，充分混合，蒸馏水7倍稀释（该卵黄取自制备参考阴性卵黄的种蛋），分装冻存于20冰箱中。2.2.3 双抗体夹心ELISA试验各反应条件的确定2.2.3.1 包被抗体工作浓度确定 用0.01mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液将小鼠抗鹅IgG稀释成5g/mL、10g/mL、20g/mL、30g/mL、40g/mL、50g/mL、60g/mL、70g/mL、80g/mL分别包被酶标反应板，对鹅血清100倍稀释进行ELISA检测。2.2.3.2 被检鹅血清的最佳稀释倍数的确定 按包被抗原的工作浓度
15、将抗原稀释，包被酶标板，然后将混合鹅血清，分别用0.1牛血清白蛋白的PBST液作40、50、60、70、80、90、100、200、400倍稀释，每个稀释度加五孔，进行ELISA检测并计算出每个稀释度的平均OD值（490nm）。选择OD值最接近于1时被检鹅血清的稀释倍数作为被检鹅血清的最佳稀释倍数。2.2.3.3 待检鹅卵黄最佳稀释倍数的确定 按包被抗原的工作浓度将抗原稀释，包被酶标板，然后将混合鹅卵黄，分别用0.1牛血清白蛋白的PBST液作4、8、10、16、20、32、64、100倍稀释，每个稀释度加五孔，进行ELISA检测并计算出每个稀释度的平均OD值（490nm）。选择OD值最接近于1
16、时被检鹅卵黄的稀释倍数作为被检鹅血清的最佳稀释倍数。2.2.3.4 按包被抗原的工作浓度将抗原稀释，包被酶标板，然后分别将五份卵黄混合，分别用0.1牛血清白蛋白的PBST液作1、2、4、8、10、16、20、32、64、100倍稀释，每个稀释度加五孔，进行ELISA检测并计算出每个稀释度的平均OD值（490nm）。选择OD值最接近于1时被检鹅卵黄的稀释倍数作为被检卵黄的最佳稀释倍数。2.2.3.5 最适抗原包被时间的确定 分别将小鼠抗鹅IgG包被后于37 3h、4过夜、37 3h后4过夜，进行测定，观察结果。2.2.3.6 最适抗原抗体反应时间的确定 将抗原抗体分别作用37 60min、90
17、min、120min，进行测定。2.2.3.7 最适酶标抗体作用时间的确定 酶标抗体作用时间分别为37 60min、90 min、120min，进行测定。2.2.3.8 最适底物作用时间的确定 底物反应时间分别为3715min、30min、45min，进行测定，观察结果。2.2.4 阳性判定值的确定ELISA检测方法在结果判断上是定性测定，对受检标本分别用“阳性”、“阴性”表示。根据国家流行病学调查要求，阳性OD值应为阴性4倍。2.2.5 ELISA检测方法的检验2.2.5.1 敏感性试验 将5份成年鹅血清的混合液以0.1牛血清白蛋白的PBST液作50、60、70、80、90、100、200、
18、400倍稀释，按照已建立的ELISA进行检测，测定OD值，确定鹅血清的敏感反应滴度。2.2.5.2 重复性试验选取数份鹅血清及鹅卵黄，按建立的ELISA进行五次检测，测定其OD值变化，观察结果。2.2.5.3 特异性试验以小鼠抗鹅血清包被反应板，成年鹅血清20份，与未用鹅IgG免疫的小鼠血清包被反应板对比，检测其OD值。3 结果3.1 鹅IgG及其抗体制备结果鹅IgG经饱和硫酸铵法粗提后，进行Sephadex-G200层析，所获得的收集液体，用751分光光度计计算蛋白含量，根据所得的OD值（280nm）绘制曲线如下图所示：Sephodex-G200纯化鹅IgG00.10.20.30.40.50
19、.61357911131517192123252729313335373941管号蛋白含量（ug/mL）蛋白含量图1 Sephodex-G200纯化鹅IgGFig 1. Purification of gooses IgG with SephodexG200经SephadexG200纯化鹅IgG所获得的曲线图可知，第一峰和第二峰出现的间隔很小，所以在收集洗脱液时，只从第二峰左侧收集蛋白OD值大于0.25的洗脱液至第二峰右侧OD值大于0.2的洗脱液。然后将此收集液浓缩，并计算蛋白含量9，10。用751分光光度计测得OD280和OD260值并按下式计算蛋白浓度，蛋白浓度(mg/mL)=(OD280
20、1.45-OD2600.74) 稀释倍数。计算鹅IgG蛋白蛋白含量为10.7318mg/mL。3.2 双抗体夹心ELISA检测方法的建立3.2.1 被检鹅血清参考阳性与鹅卵黄参考阴性的最佳稀释倍数的确定表 4 被检血清的最佳稀释倍数的确定Table 4 Determination of serum dilution孔号12345678稀释倍数481016203264100血清平均OD值1.311.261.271.261.241.161.100.98血清参考阴性平均OD值0.310.290.290.280.240.240.210.19由以上表可知，将血清100倍稀释时，其OD值最接近1.0，参考
21、阴性为0.19，符合P/N4，因此，在检测时将血清100倍稀释。3.2.2 被检鹅卵黄参考阳性与鹅卵黄参考阴性的最佳稀释倍数的确定表 5 被检卵黄的最佳稀释倍数的确定Table 5 Determination of yolk dilution孔号12345678稀释倍数481016203264100卵黄平均OD值1.21.091.060.10.970.730.670.44卵黄参考阴性平均OD值0.360.310.250.240.210.150.120.09由以上表可知，将卵黄进行20倍稀释时，其OD值最接近1.0，参考阴性为0.21，符合 P/N 4， 因此，在检测时将卵黄20倍稀释。3.2.
22、3 最适底物作用时间的确定表 6 最适底物作用时间 Table 6 Results of various incubated time of substrate孔号123处理方法20 min30 min45 min平均OD值0.831.021.22底物反应时间分别为37 15 min、30 min、45 min，进行测定后，试验结果表明，当底物的作用时间30 min时，初乳的OD值为1。因此将底物作用时间确定为30 min。3.2.4 IgG敏感性试验结果在血清中，当已知含量的鹅IgG稀释至0.0683594 g/mL时，OD值不再有变化。表7 血清敏感性试验结果Table 7 Results
23、 of sensitivity experiment for serumIgG含量(g/mL)8.7504.3752.1881.0940.5470.2730.1380.068.03420.017平均OD值0.760.680.620.450.410.40.390.230.20.21在血清中，当已知含量的鹅IgG稀释至0.0341767g/mL时，OD值不再有变化，即该检测方法检测的灵敏度为0.0341767g/mL。表8 卵黄敏感性试验结果Table 8 Results of sensitivity experiment for egg yolkIgG含量(g/mL)70605040302010
24、510.5平均OD值0.37010.340.330.2950.280.260.250.230.2350.23 在卵黄中，当已知含量的卵黄稀释至5g/mL时，OD值不再有变化，即该方法的灵敏性为5g/mL。3.2.5 重复性试验结果取参照IgG进行ELISA检测，3次不同时间的结果基本一致，说明本研究建立的双抗体夹心ELISA方法具有相对较好的稳定性和重复性。3.2.6 包被特异性试验结果将正常小鼠血清1:100倍稀释，免疫过鹅IgG的小鼠血清按1:100倍稀释，进行比较，结果表明正常小鼠血清与免疫的小鼠血清OD值差异显著。表9 包被抗体特异性实验结果Table 9 results of coa
25、ting antibody specificity test孔号小鼠血清免疫鹅IgG的小鼠血清稀释倍数1：1001：100平均OD值0.130.983.3 蛋白标准含量曲线检测结果3.3.1 双抗体夹心ELISA OD值与卵黄IgG含量的标准曲线双抗体夹心ELISA OD值与卵黄IgG含量通过做图看出它们之间成幂函数关系，故求得回归方程为y145.42ln(x)214.77表10 双抗体夹心ELISA OD值与鹅卵黄IgG含量Table10 double antibody sandwich ELISA OD and content of IgG in egg yolkIgG（ug/mL） OD
26、值140 0.605120 0.515110 0.48590 0.42560 0.0.3450 0.3340 0.29530 0.2820 0.2610 0.255 0.23 1 0.235 0.5 0.23图2双抗体夹心ELISA OD值与鹅卵黄IgG含量Fig.2 double antibody sandwich ELISA OD and content of IgG in egg yolk3.3.2 双抗体夹心ELISA OD值与血清IgG含量的标准曲线双抗体夹心ELISA OD值与血清IgG含量通过做图看出它们之间成幂函数关系，故求得回归方程为y=23.865x5.6726表11 双抗
27、体夹心ELISA OD值与血清IgG含量Table11 double antibody sandwich ELISA OD and content of IgG in serumIgG（ug/mL） OD值140 1.470 1.1735 1.0517.5 0.98 8.75 0.824.375 0.742.1875 0.68 1.09375 0.56 0.546875 0.480.2734375 0.490.0683594 0.36图3双抗体夹心ELISA OD值与IgG含量Fig.3 double antibody sandwich ELISA OD and content of IgG3
28、.4 鹅血清中IgG含量与鹅卵黄中IgG含量变化的比较表14 14.5天和34.5天鹅胚血清中IgG含量与鹅卵黄IgG含量的比较Table14 Comparison of IgG in serum and egg yolk（有错误）日龄卵黄IgG含量（ug/mL）血清IgG含量（ug/mL）14.5d3967.6223.86640.17173.362E-0234.5d2821.36341.50721495.641380.9186图4由图4可见，鹅胚血清中IgG抗体从14.5日龄0.1717g/mL升高到34.5日龄（出壳3.5天）1495.6413g/mL，差异显著（P0.05）；鹅卵黄中Ig
29、G抗体从14.5日龄3967.62g/mL到34.5日龄(出壳后3d)降至2821.363g/mL,差异显著(P0.05)。整个阶段鹅血清中IgG抗体含量总体呈现上升的趋势；而鹅卵黄IgG抗体含量总体呈现下降的趋势；但是血清中抗体含量浓度的最高值(1495.6413g/mL)也未超过卵黄抗体浓度的最低值(2821.363g/mL),卵黄中抗体浓度远高于血清中抗体浓度。4 讨 论4.1 双抗体夹心ELISA法近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫
30、(RIA)分析技术之后，1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法，建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术，是一种用酶标记抗原或抗体的方法。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来。ELISA试验是一种敏感性高，特异性强
31、，重复性好的实验诊断方法。将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来，可敏感地检测体液中微量的特异性抗体或抗原。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。4.2 鹅血清抗体及卵黄抗体变化在卵黄抗体与血清抗体的比较结果中，可以发现卵黄抗体与血清抗体的消长规律在浓度上并不对应。似乎卵黄抗体浓度并未减少，而且血清中抗体含量浓度的最高值也未超过卵黄抗体浓度的最低值，但是总体上趋于上升的趋势。这一现象试验者有如下解释：第一，虽然卵黄抗体的浓度变化不大，但是卵黄抗体的体积却发生了很大
32、的变化，在14.5日龄以后变化较明显，而在34.5日龄以后卵黄抗体的体积为0，据此，虽然卵黄抗体的含量无明显变化，但是，由于体积的改变，卵黄抗体（总量上）也在被动的向鹅胚血清转移；第二，试验者认为卵黄抗体在整个孵化过程中，除了被动转移给鹅胚血清外，还有其他功能，如提供能量、提供形成组织的原料等，因此，鹅胚血清中的抗体在总量上也少于卵黄中的抗体总量，也成了血清中抗体浓度小于卵黄中抗体浓度的可能原因之一。5 结 论5.1 鹅血清中和鹅卵黄中IgG含量鹅胚血清中IgG抗体从14.5日龄0.1717g/mL升高到34.5日龄（出壳3.5天）1495.6413g/mL，差异显著（P0.05）；鹅卵黄中I
33、gG抗体从14.5日龄3967.62g/mL到34.5日龄(出壳后3d)降至2821.363g/mL,差异显著(P0.05)。目前在国内尚未见到有关测定鹅IgG含量的相关报道。5.2 鹅血清中和鹅卵黄中IgG含量变化趋势从14.5日龄和34.5日龄（出壳3.5天）检测结果可知：鹅胚血清中IgG抗体含量总体呈现上升的趋势（0.1717g/mL1495.6413g/mL）；而鹅卵黄IgG抗体含量总体呈现下降的趋势(3967.62g/mL2821.363g/mL)；但是血清中抗体含量浓度的最高值(1495.6413g/mL)也未超过卵黄抗体浓度的最低值(2821.363g/mL),可见，卵黄中抗体浓
34、度远高于血清中抗体浓度。参 考 文 献1 陈雪岚,许杨,熊勇华.中国大耳白兔与罗曼母鸡对赭曲霉素A抗原免疫应答性的研究J.卫生研究,2003,1.2 Jensenius J C,Andersen I,Hau J,et a1Eggs：conveniently packaged antibodiesMehtods for purification of yolk IgGJJ Immunol methods,1981,46(1)：63683ROSE,M.E.ORLANS,E.Immunoglobulinsintheegg,embryoandyoungchick.JDevelopmental and
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