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1、荧光定量PCR步骤一土壤基因组DNA提取(一)试剂和仪器:1. 乙醇(96%-100%)2. 异丙醇3. 离心机4. 漩涡振荡器5. 水浴锅6. 电子天平7. 超净工作台8. 1000ul、100ul移液枪;灭菌枪头9. 1.5ml灭菌离心管、2ml灭菌离心管10. 称量纸、称量勺、滤纸、酒精棉球、镊子等(二)提取步骤(OMEGA试剂盒 E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit):提取前准备工作:按说明书的比例用乙醇稀释SPW Wash Buffer。1. 打开水浴锅预热70(70预热Elution Buffer),用1.5ml离心管,取0.5g土壤,加入0.5g玻璃珠,加入1ml Bu
2、ffer SLX MLus,立即在涡旋仪上最高速涡旋3min,使菌体进入溶液(豆粕的改为:打开水浴锅预热70,取3g豆粕到50mL离心管中,加入27mL水,3000rpm离心5min,重复3次各取4mL上清到5mL离心管,13000rpm离心2min,弃上清,加0.5g玻璃珠,加1mL Buffer SLX MLus,立即在涡旋仪上最高速涡旋3min,使菌体进入溶液);2. 加入100ul Buffer DS,涡旋混匀;3. 转移至预热至70水浴锅中水浴10min,水浴过程中轻轻翻转一次(若存在较难溶解的细菌,水浴温度可增加到90),使菌体裂解;4. 3,000 rpm室温离心3min,转移8
3、00ul上清液到新的2ml离心管中,并加入270ul Buffer SP2涡旋混匀;(离心时准备冰盒)5. 置于冰中5min,13,000 xrpm、4离心5min(配平);6. 在超净台中把上清液转称至新的2ml离心管中,加入0.7倍(749ul)的异丙醇,翻转混匀20-30次,把样品置于-20 1h;7. 13,000 rpm、4离心10min,沉淀DNA(可能看不到沉淀);8. 倒弃上清液,并反扣于吸水纸上1min, 若还有残留,则在超净台中用移液器吸去;9. 加入70预热的200 ul Elution Buffer,涡旋10s,65水浴15min,让DNA充分溶解(如果想得到不含RNA
4、的DNA,在这一步向样品中加10ul 25mg/mL的RNA酶A);10. 用剪过的黄枪头加入50ul HTR Reagent(使用前充分摇匀),漩涡混合10s;11. 置于室温2min,13,000 rpm离心2min, 使HTR Reagent沉降;12. 转移上清液至新的2ml离心管(若经HTR Reagent提取后样品仍然显棕色或深色,重复步骤10-12);13. 加入与上清液等体积(约200ul)XP2 Buffer, 漩涡震荡充分混匀;14. 将上步所得溶液加到吸附柱(柱子套在2ml收集管中),12,000 rpm 室温离心1min,弃上清液,保留收集管;15. 柱子重新套在上步收
5、集管中,加入300ul XP2 Buffer,12,000 rpm 室温离心1min,弃上清液和收集管;16. 柱子套在新的2ml收集管中,加入700ul SPW Wash Buffer(经乙醇稀释),12,000 rpm室温离心1min,弃上清液,保留收集管;17. 柱子重新套在上步收集管中,重复步骤16;18. 柱子重新套在上步收集管中,13,000 x g 室温空离2min,使吸附柱干燥(空离完后在超净台中开盖晾干2min。该步对去除乙醇残余至关重要,乙醇残留可能会影响下游酶的使用);19. 把柱子置于新的1.5ml离心管,枪头不要碰触吸附柱,垂直悬空加加30ul Elution Buf
6、fer至吸附柱中央,65水浴15min, 13,000 x g离心1min,洗提回收DNA;20. 换个1.5ml离心管,重复上步(不需要水浴);21. 将两次得到的DNA溶液合并后再分装两管,每个30ul,一个放4常用,另一个-20低温储存。22. 用微量之外分光光度计测定提取的DNA浓度,OD260/OD280约为1.8左右,过低有蛋白质和酚污染,过高有RNA存在。二琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA产物(1%琼脂糖凝胶)(一)试剂和仪器1. EDTA、NaOH、Tris、乙酸2. EB3. 琼脂糖4. 10ul移液枪5. 电泳槽6. 电泳成像系统(二)药液配制1. 50TAE缓冲液(pH8.3
7、):称取Tris 242g,Na2EDTA2H2O 37.2g,向烧杯中加800ml的去离子水,充分搅拌溶解;加入57.1mL乙酸,使用去离子水定容至1L,高压灭菌后保存于室温。2. 1TAE缓冲液:例如需要使用200ml的1*TAE,则量4ml的50*TAE,196ml的去离子水,混匀即可。(三)步骤1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用60ml,小胶用30ml): 称取0.6g(0.3g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入60ml(30ml)1TAE,该上盖子。微波炉加热煮沸,煮沸后转两圈取出摇匀,重复一次,至琼脂糖全部融化,摇匀。用水冷却锥形瓶至50-60,加入6ul(3ul)EB,摇匀,倒入内槽玻璃板
8、上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层,若有气泡需赶走气泡,插好梳子,室温下静置直至凝胶完全凝固(20min左右)。2. 垂直轻拔梳子,将凝胶及内槽放入电泳槽中。从负极(黑色)处添加 1TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。3. 加样: 用10 ul微量移液器在第一孔添加5ul Marker;取样品3ul,与2ul Loading buffer在点样板或PE手套上混合,用分别将样品加入凝胶槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。(注意:加样前要先记下加样的顺序)。4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压120V,时间20min,
9、n=1-1。样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。5. 观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出荧光条带,凝胶成像系统拍照保存。三、普通PCR扩增(一)耐药基因的特异性引物如表1如示(由北京奥科公司合成)表1耐药基因的引物序列目标基因引物引物序列(5-3)目标片段大小(bp)参考文献ermBermB-91fGATACCGTTTACGAAATTGG364Chen et al, (2007)ermB-454rGAATCGAGACTTGAGTGTGCermFermB-189fCGACACAGCTTTGGTTGAAC309Chen et al, (2007)ermB-497rGGACCTACC
10、TCATAGACAAGermTermB-52fCATATAAATGAAATTTTGAG369Chen et al, (2007)ermB-420rACGATTTGTAT TAGCAACC(二)耐药基因的PCR扩增反应体系均为25L(表2),表2耐药基因的PCR扩增反应体系组分(L)ermBermFermT2Mix12.5012.5012.50上游引物(10M)0.500.500.5下游引物(10M)0.500.500.5DNA模板1.001.001.00灭菌超纯水10.5010.5010.50(三)各基因的PCR扩增反应条件如表3所示。表3耐药基因的PCR扩增反应程序步骤ermBermFerm
11、T1预变性94,240s94,240s94,240s2变性94,45s94,45s94,30s3复性(退火)58,45s56,45s49,30s4延伸72,45s72,45s72,45s5循环数(24步骤)(次)3535356再延伸72,360s72,360s72,360s7保存4,1h4,1h4,1h四琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物(2%琼脂糖凝胶)(一)试剂和仪器7. EDTA、NaOH、Tris、乙酸8. EB9. 琼脂糖10. 10ul移液枪11. 电泳槽12. 电泳成像系统(二)药液配制1. 50TAE缓冲液(pH8.3):称取Tris 242g,Na2EDTA2H2O 37.2g
12、,向烧杯中加800ml的去离子水,充分搅拌溶解;加入57.1mL乙酸,使用去离子水定容至1L,高压灭菌后保存于室温。2. 1TAE缓冲液:例如需要使用200ml的1*TAE,则量4ml的50*TAE,196ml的去离子水,混匀即可。(三)步骤6. 制备2%琼脂糖凝胶(大胶用60ml,小胶用30ml):称取1.2g(0.6g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入60ml(30ml)1TAE,该上盖子。微波炉加热煮沸,煮沸后转两圈取出摇匀,重复一次,至琼脂糖全部融化,摇匀。用水冷却锥形瓶至50-60,加入6ul(3ul)EB,摇匀,倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层,若有气泡需赶
13、走气泡,插好梳子,室温下静置直至凝胶完全凝固(20min左右)。7. 垂直轻拔梳子,将凝胶及内槽放入电泳槽中。从负极(黑色)处添加 1TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。8. 加样: 用10 ul微量移液器在第一孔添加5ul Marker;取样品5ul用分别将样品加入凝胶槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。(注意:加样前要先记下加样的顺序)。9. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压120V,时间20min,n=1-1。样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。10. 观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出荧光条带,采用凝胶成像系
14、统拍照保存。11. 若有目的条带则将PCR产物(剩余PCR产物20ul左右,上游引物10ul或上下游引物各10ul)送至北京奥科公司进行测序,根据测得的序列在NCBI上进行同源性比对,同源性应大于98%,判断是否为目的耐药基因。五胶回收(一)试剂和仪器:1.乙醇(96%-100%)3.离心机5.水浴锅8.移液枪;灭菌枪头9.1.5ml灭菌离心管、2ml灭菌离心管 (二)提取步骤(OMEGA试剂盒 E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit): 提取前准备工作:A.按说明书的比例用乙醇稀释SPW Wash Buffer;B.调节水浴的温度为50-55;C.65预热的Elution
15、 Buffer。1. (普通PCR反映体系为25ul,需要两管,共50ul,插大梳子,用1.52的胶,将两管全打入一个孔)琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,推荐使用新鲜的TAE/ TBE Buffer和新配制的胶。2. 片段完全分离后,在紫外灯下迅速切取所需条带,DNA在紫外灯下爆光时间不超过30s,。 3. 切取下来的胶放入1.5ml的离心管,按照每1g凝胶加入1ml Binding Buffer(XP2)对应量,即胶与XP2以1:1体积混合(一般将凝胶全部淹没即可),50-55水浴至凝胶完全溶解(约7min)。每隔2-3mi n翻转一次。注意: 当pH8,DNA会明显降解。当Binding B
16、uffer完全溶解凝胶后,请注意溶液颜色的变化。如果溶液颜色已经变成紫色或红色,必须加入5ul 5M NaAc, pH5.2至溶液中调整pH值,溶液颜色变成浅黄色。4. 把HiBind DNA柱子套在提供的2ml收集管中。5. 降温后,把700ul溶好的胶加HiBind DNA柱子中(不要垂直冲柱子),10,000 x g(12,000 rpm)室温离心1 min。6. 倒去滤液,把柱子装回收集管中,HiBind柱一次能装700ul溶液,若混合液超过700ul,每次转移700ul至柱子中,然后重复5-6步骤,直至胶加到完到柱子中。7. 把柱子重新装回收集管,加入300ul Binding Bu
17、ffer(XP2);10,000 x g(12,000 rpm)室温离心1 min。弃去滤液。8. 把柱子重新装回收集管,加入700ul SPW Wash Buffer(经乙醇稀释);10,000 x g(12,000 rpm)室温离心1 min,弃去滤液。9. (可选)重复步骤8一次。10. 把柱子重新装回收集管,13,000 x g(13,000 rpm)空离柱子2min以甩干柱子基质。11. 把柱子装在新的1.5ml离心管上,加入15-30ul 65C预热的Elution Buffer到柱子基质上,室温静置1min;13,000 x g(13,000 rpm)室温离心1min,洗脱出DN
18、A。六、LB培养基配制(一)LB液态培养基(配100ml,可做500个样,一般只需要称量、加水、灭菌)1称量用200ml烧杯按LB肉汤说明称量,加超纯水。2溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后,补充水分到所需的总体积。3调pH在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值,如果pH偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH值,直至pH达7.6。反之,则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头,以避免回调,否则,将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的
19、微生物,其pH的调节可用酸度计进行(使用方法,可参考有关说明书)。4分装按实验要求,可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内,本试验用250ml蓝盖大口瓶分装。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而引起污染。液体分装分装高度以瓶口高度的1/4左右为宜。5灭菌用记号笔注明培养基名称、组别、日期。将上述培养基以1.05kg/cm2(15磅/英寸2),121.3,20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌,则应放入冰箱内暂存。6无菌检查将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时,以检查灭菌是否彻底。4保存。(二)LA液态培养基(每100mL的LB中加100uL氨苄青霉素,
20、配1L,可做62个样)1称量用1L烧杯按LB肉汤说明称量,加超纯水。2溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后,补充水分到所需的总体积。3调pH在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值,如果pH偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH值,直至pH达7.6。反之,则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头,以避免回调,否则会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物,其pH的调节可用酸度计进行。4分装按实验要求,可将配制的培养基分装入试管内或三角烧
21、瓶内,本试验用250ml蓝盖大口瓶分装。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而引起污染。液体分装分装高度以瓶口高度的1/4左右为宜。5灭菌用记号笔注明培养基名称、组别、日期。将上述培养基以1.05kg/cm2(15磅/英寸2),121.3,20分钟高压蒸汽灭菌。6. 抗生素的加入:高压灭菌后,将融化的LB培养基置于55的水浴中,待培养基温度降到55时(手可触摸)加入抗生素,以免温度过高导致抗生素失效,并充分摇匀。4保存。(三)LA固态培养基(配200mL,可做20个板左右)1称量用500ml烧杯按LB琼脂说明称量,加超纯水。2溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量,用玻棒
22、搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后,补充水分到所需的总体积。3调pH在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值,如果pH偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH值,直至pH达7.6。反之,则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头,以避免回调,否则,将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物,其pH的调节可用酸度计进行(使用方法,可参考有关说明书)。4分装按实验要求,可将配制的培养基分装入三角烧瓶内,分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而引起污染。固体分装三角烧瓶的
23、量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。5加塞培养基分装完毕后,在三角烧瓶口上塞上棉塞,以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染,并保证有良好的通气性能。6包扎三角烧瓶加塞后,外包牛皮纸,用麻绳以活结形式扎好,使用时容易解开,同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。7灭菌用记号笔注明培养基名称、组别、日期。将上述培养基以1.05kg/cm2(15磅/英寸2),121.3,20分钟高压蒸汽灭菌。8. 抗生素的加入:高压灭菌后,将融化的LB培养基置于55的水浴中,待培养基温度降到55时(手可触摸)加入抗生素,以免温度过高导致抗生素失效,并充分摇匀。3.倒板:一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后,打开
24、盖子,在紫外下照10-15分钟。4.保存:用封口胶封边,并倒置放于4保存,一个月内使用。六、载体的连接与转化准备:1PMD18-T Vector载体试剂盒2E.coll Competent Cells DH5感受态细胞(-80保存,取出置于4冰种融化)3LB培养基 Day1晚上10点:(1)将纯化的PCR产物用于PMD18-T Vector载体的连接,连接体系为:1ul PMD18-T Vector,4ul PCR产物(模板),5ul Solution 。轻轻混匀,在PCR仪上16放置11h,4 forever,拿出时放在冰上;Day2中午12地点:(2)反应结束后,将连接产物全量(10 ul
25、)螺旋加入至50 ul E.coll Competent Cells DH5感受态细胞中,注意须在感受态细胞刚刚解冻时螺旋加入连接产物,螺旋吹打混匀,冰中放置30min(开42水浴锅和37摇床);(3)将加了连接产物的感受态细胞的离心管置于42的水浴中热激45s,后立即置于冰上2min,期间尽量不要摇动离心管;(4)往离心管里加200 ul的LB肉汤培养液(无氨苄霉素)。37,160r/min振荡培养45min。(5)在超净台上灼烧玻璃棒,取离心管的全量涂布到LA平板培养基(含有氨苄霉素)上养菌,37过夜培养16h(开始正放,3h后倒放培养皿)。Day3早上8点:七、重组子鉴定第2天挑选白色单
26、个菌落于含980ul LA的肉汤培养液(含氨苄霉素)的1.5mL灭菌离心管中(用小的枪头挑菌,把枪头一并达到1.5ml离心管中,一个片段做6个管),220r/min摇菌大于3h,在超净台上把枪头打掉,取1ul菌液以原有的PCR引物对菌液进行扩增(一个片段6个),取5ul PCR产物用120V,2%琼脂糖凝胶电泳检测是否含有目的片段(作不加模板的阴性照),每个片段选取两个条带较亮的样所对应的200ul菌液送测序,确认目的基因。期间离心管放到37培养箱中继续摇菌,琼脂平板培养基放4冰箱保存。八、质粒的培养与提取阳性菌液以1:50扩摇(如:用10ml离心管,加5ml LA肉汤培养液,再加100ul阳
27、性菌液),一管阳性菌液扩两管,37,220r/min摇菌16h。Day4早上9点:第2天看菌液是否浑浊,如果浑浊,则可用于后续质粒提取.提取质粒前取1ml菌液到1.5ml的灭菌离心管中进行保菌。质粒提取步骤参照OMEGA质粒提取试剂盒。质粒提取具体步骤为:(1)用上述10mL离心管所含菌液,12,000r/min离心5min,弃上清液;(2)加入250L RNase A与Solution的混合液(事先混合于4保存),漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。转移到2ml灭菌离心管中,室温静置1-2min;(3)加入250L Solution,轻轻地反复颠倒混匀5-6次,避免剧烈混匀。室温放置1-2mi
28、n,使菌体充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液,此步不能超过5min;(4)加入350L Solution,立即轻柔地反复颠倒5-6次,避免局部沉淀,此时会出现白色絮状沉淀,12,000r/m室温离心10min,收集上清液,迅速进行下步;(5)马上将上清液置于DNA纯化柱中12,000r/min离心1min,弃滤液;加入500L溶液HB,12,000r/min离心1min,弃滤液;(6)加入700L溶液SPW Wash Buffer,12,000r/min离心1min,弃滤液;重复本步骤1次;(7)13,000r/min空离3min,以除尽纯化柱中残留的液体,弃收集管;(8)将DNA纯化柱置于新的
29、1.5mL的离心管中。向纯化柱中间处悬空滴加50L的灭菌去离子水,室温放置2min。12,000r/min离心1min,管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA于-20保存;(9)在琼脂糖上鉴定所提取出的质粒,用核酸定量仪记录质粒的浓度和260/280的比值,用于拷贝数的计算。九、荧光定量PCR反应1.标准曲线的制作将已知浓度的质粒DNA用灭菌超纯水进行10倍梯度稀释,稀释成八个梯度,使得PCR产物的浓度为原来浓度的10010-7,以稀释后的PCR产物为模板,按照定量PCR反应体系和反应条件进行PCR扩增,每个梯度3个重复,同时做3个阴性对照。拷贝数的计算:以Ct值为横坐标,不同浓度的样品拷贝数对
30、数值为纵坐标,制成标准曲线每g质粒DNA基因拷贝数按以下公式计算(Whelan等,2003):(式2.1)式中,L是阿弗加德罗常数(6.021023);C是质粒DNA浓度(已测);N是目标基因的模板长度(需要加上大肠杆菌的,若目标基因的为350,则需加上大肠杆菌的2992,bp);M是每对DNA的平均分子量660 bp。根据实时荧光定量PCR的测定原理,以Ct值(Y)为横坐标,以起始拷贝数对数值(X)为纵坐标,数学模型为:Y = AX + B曲线的扩增效率公式为:E(%)=(101A 1)100 (式2.2)2.荧光定量PCR反应定量PCR反应体系为20L,具体为:10.0L THUNDERB
31、IRD SYBR qPCR mix(避光保存),0.5L上游引物(10M),0.5L下游引物(10M),0.04L ROX染料(避光保存),1L DNA模板,7.96L H2O(8L)。(一般配100个孔的:1000L mix、800L 水、50L 上游引物、50L 下游引物、4L ROX,然后每个孔加1L DNA模板)定量PCR反应在带有7500 Software v2.0.5分析软件的ABI 7500荧光定量PCR仪上进行,具体的定量PCR反应程序见下表。表 耐药基因的荧光定量PCR反应程序步骤热循环程序1预变性95,2min2变性95,15s3退火60,30s4延伸72,30s5循环数(
32、24步骤)(次)406溶解曲线默认(第二个温度与退火温度一致)注:溶解曲线程序:95,15s;60,1min;95,30s;60,15s。十、上机1. 选择Advanced Setup(选择第4个)2. Experiment-Properties2.1 命名2.2 7500(96 Wells)(默认)2.3 Quantitation-Standard Curve(默认)2.4 SYBR*Green Reagents(选择第2个)2.5 Standard(2 hours to complete a run)(默认)3. Plate Setup:选中96孔标为U(未知待测),选中Sample1,Define and Set Up Standards,分别填32、3、10000、1:10,Apply,Close。也可选中某些孔标为S(做标曲),其他的标为U。4. Run Method4.1 选择体系20L4.2 参考应该定量PCR反应程序5. Reaction Setup(默认)6. Materials List(默认)7. Run:START RUN