谷氨酸发酵工艺讲义-刘晓玲.ppt

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1、谷氨酸生产工艺原理及流程设备,2011年9月,培训人：刘晓玲,2,目录,二,三,谷氨酸生产的工艺流程以及主要设备,一,谷氨酸的生产工艺原理及其应用,谷氨酸清洁生产,四,问题讨论,3,一、发酵基础知识,1、什么是发酵（1）传统的发酵定义：发酵(fermentation)最初来自拉丁语“发泡”(fervere)，人们早期的认识，发酵是指酵母作用于果汁或谷物，进行酒精发酵产生CO2的现象，这个过程是酵母在无氧状态下的呼吸过程，是微生物获得能量的一种形式。微生物：是对所有形体微小，肉眼看不见，单细胞或个体结构为简单多细胞，甚至没有细胞结构的低等生物的通称。（2）现在定义：目前人们把借助微生物在有氧或无

2、氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或直接代谢产物或次级代谢产物的过程统称为发酵。,4,三、发酵类型,根据对氧的需求细胞呼吸方式可以分为：好氧性、厌氧性和兼性厌氧性 1、微生物菌体发酵 微生物菌体发酵是以获得微生物菌体为目的，如：面包酵母发酵、单细胞蛋白发酵（利用各种碳源）、真菌类（各种蘑菇、冬虫夏草）、生物防治剂（苏云金杆菌，伴孢晶体可以毒杀鳞翅目、双翅目害虫）。2、微生物酶发酵 微生物酶发酵是以获得酶为目的的发酵，如青霉素酰化酶，用于半合成青霉素时，制备中间体6氨基青霉烷酸。3、微生物代谢产物发酵 是以微生物代谢产物作为产品的发酵生产。是发酵工业中数量最多、产量最大，也是最重要的部分。

3、,5,谷氨酸发酵：在人工控制的条件下，谷氨酸生产菌通过本身新陈代谢的活动，将发酵培养基中的不同物质进行发酵分解和合成产生主要的代谢产物谷氨酸，这个生产工艺的过程就叫谷氨酸发酵。谷氨酸发酵必须具备以下条件：发酵培养基、控制合理的发酵条件（设备、工艺等）、优良的菌种，才能达到谷氨酸稳产高产的目的。,6,染菌：指发酵生产过程中污染了生产菌以外的其它微生物（细菌），破坏了单一微生物生长培养的环境。消毒：用物理和化学的方法杀灭物体上的病原微生物，使之不能成为传染源即为消毒。消毒的作用是毁灭引起感染的病原微生物，而不一定能毁灭一切微生物和孢子。灭菌：用物理和化学的方法，杀灭和除去所有微生物的繁殖体和芽孢，

4、使之完全无菌即为灭菌。灭菌的作用是指杀灭一切微生物及其孢子。,7,三、辐射防护的目的与任务,辐射防护的主要目的是在保证不对伴随辐射照射的有益实践造成过度限制的情况下为人类提供合适的保护。具体来讲，就是要防止有害的确定性效应，并限制随机性效应的发生率，使之达到被认为可以接受的水平。,8,既要保护环境，保障从事辐射工作人员和公众成员，以及他们的后代的安全和健康，又要允许进行那些可能产生辐射照射的必要活动；提高辐射防护措施的效益，以促进核科学技术、核能和其它辐射应用事业的发展。,9,细菌的致死时间：在一定温度下，杀死细菌所需要的最短时间。细菌的致死温度：在一定时间内，杀死细菌所需要的最低温度。死角：

5、在消毒灭菌过程中蒸汽高温所达不到或消不透的部位称死角，主要指设备结构上的死角和人在操作中够成的死角两大类。,10,碳氮比：是指培养基中碳元素与氮元素的物质量之比，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比碳氮比对谷氨酸发酵影响很大，在发酵的不同阶段，控制碳氮比以促进以菌体生长为主的阶段向产酸阶段转化。在长菌阶段，如NH4+过量也会抑制菌体生长；在产酸阶段，如NH4+不足，-酮戊二酸不能还原并氨基化，几乎不积累谷氨酸，而积累-酮戊二酸。,11,接种量：是指接入培养基中种子的体积与培养基总体积之比。营养缺陷型：某些菌株发生突变后，失去合成某种对该菌株生长必不可少的物质（通常是生长因子）的能力，必须从外界环

6、境获得该物质才能繁殖生长，这种突变型菌株称为营养缺陷型。谷氨酸产生菌就是生物素缺陷型菌株。,12,噬菌体：是指侵染细菌、放线菌等微生物并使其细胞裂解死亡的一类病毒。种龄：是指种子的培养时间，种龄长短关系到种子活力的强弱。通风比：是指单个罐容量与罐内单位时间内的通气量之比,从大的范围讲通风比是指发酵的整个累加罐容量与空压机的总产气量之比。,13,生长因子：通常是指微生物生长所必须而且需要量很小，但微生物自身不能合成或者合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。OD:OD值是发酵培养基浓度的色度，菌体量和菌体伸长膨大的一个综合性的指标，净增OD则主要是菌体生长量和菌体伸长膨大所致。在谷氨酸发酵过程

7、中，一般的以净增OD为依据控制通风量及温度的。,14,速效碳源（氮源）：微生物对不同物质的利用能力不同，有的物质可直接被利用（例如葡萄糖和NH4+）,这样的物质称为速效碳源（氮源）。迟效碳源（氮源）：微生物对不同物质的利用能力不同，有的物质经过一定的适应期后才能获得利用的能力（例如乳糖和NO3-）,这样的物质称为速效碳源（氮源）。,返回,15,连消：将培养基经汽水混合器连续加热，维持和冷却，然后进入发酵罐，这种方法叫连消。实消：实消是利用通入高温蒸汽提高料液温度对微生物杀灭的过程。消泡剂的灭菌就是实消的过程。空消：相对于实消而言的，空消是利用高温高压蒸汽的高温及其渗透性对设备管道内微生物进行灭

8、杀的过程,16,培养基：是人工配制的用于微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养物质。包括碳源、碳源、无机盐、生长因子和水。原则：选择适宜的营养物质、合适的营养物质浓度及合适配比、合适的PH、渗透压、氧化还原电位碳源是供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及合成谷氨酸的碳架的来源。谷氨酸产生菌是异养微生物，只能从有机化合物中取得碳素的营养，并以分解氧化有机化合物产生的能量供给细胞中合成反应所需要的能量。通常谷氨酸发酵中用作碳源的物质主要是糖类。,培养基,17,培养基中糖浓度对谷氨酸发酵有很大影响。在一定范围内，谷氨酸产酸率随糖浓度增加而增加，但当糖浓度过高时，由于渗透压增大，对菌体生长和发酵均不

9、利，当工艺条件配合不当时，糖酸转化率相当低。同时培养基浓度大，氧溶解的阻力也增大，影响供氧效率。为了降低培养基中糖浓度而又提高产酸水平，目前国内普遍采用低浓度初糖的流加糖发酵工艺。,18,氮源：是合成菌体蛋白质、核酸等含氮物质和合成谷氨酸氨基的来源。同时，在发酵过程中一部分氨用于调节发酵液pH。因此，谷氨酸发酵需要的氮源比一般的发酵工业要高，一般发酵工业碳氮比为100:0.22.0，而谷氨酸发酵的碳氮比为100:1530。当培养基中碳氮比在100:11以上才开始积累谷氨酸。在谷氨酸发酵中，用于合成菌体的氮仅占总耗用氮的38%，而3080%用于合成谷氨酸。在实际生产中，由于一部分氨用于调节pH，

10、一部分随空气逸出，造成实际用量较大。,19,氮源有无机氮和有机氮之分。无机氮如尿素、液氨、氨水、碳酸氢铵、硫酸铵、氯化铵和硝酸铵等。菌体利用无机氮源比较迅速，而利用有机氮较缓慢。铵盐、尿素和液氨等比硝基氮优越，因为硝基氮需先经过还原后才能被利用。一般要根据菌种和发酵特点合理地选择氮源。目前，考虑到生产成本、操作方便等因素，谷氨酸发酵已全部采用液氨作为无机氮源。由于液氨作用快，对pH影响大，故生产上都采用连续流加方法。2.有机氮源主要是蛋白质、蛋白胨和氨基酸等。谷氨酸发酵的有机氮源常用玉米浆、麸皮水解液、米糠水解液、豆饼水解液和糖蜜等。有机氮，尤其是氨基酸丰富则有利于长菌。谷氨酸发酵时对有机氮的

11、需要量不大。,20,3、无机盐：无机盐是构成菌体的重要成分，是菌体维持生命活动不可缺少的物质，它起到调节微生物生命活动的作用，其主要功能是：、构成菌体细胞成分；、作为酶的组成部分；、酶的激活剂或抑制剂；、调节培养基的渗透压、PH值和氧化还原电位。无机盐主要有：磷酸盐、硫酸盐、氯化物、和含钾、钠、镁、的化合物以及一些微量元素如：锰、铁、铜、锌、钴、钼、硫、碘、溴等。,21,、磷酸盐：磷是蛋白质和核酸的必要成分，三磷酸甘泉（ATP）、二磷酸甘泉（ADP）是重要的能量传递着，参与一系列的代谢反应。磷酸盐在培养基中有缓冲作用。磷含量高低对发酵生产的影响很大，磷浓度过高，菌体生长旺盛，谷氨酸发酵转向缬氨

12、酸发酵，如果磷浓度过低，会使糖代谢变慢，影响菌体增殖，菌体生长不好。培养基中一般配制浓度为0.1%0.16%之间（磷酸氢二钾）。用Na2HPO4代替K2HPO4时，由于它们分子量不同，所以Na2HPO4是K2HPO4的1.6倍为0.160.0.26%（另补充钾盐）。生产上常用的磷酸盐有：K2HPO43H2O、Na2HPO412H2O、H3PO4。,22,硫酸镁：镁是组成某些细菌叶绿素的成分。它的离子状态是酶的激活剂，能刺激菌体生长。硫是构成蛋白质和某些酶的活性基。谷氨酸发酵培养基中的硫酸镁的用量为0.0250.1%。、钾盐：它不参与细胞结构物质的组成，是许多酶的激活剂。菌体进入谷氨酸合成期后对

13、钾离子的需要量远远大于菌体增殖时对钾的需要量。菌体生长时需要量0.1g/L，产酸时需要量0.21.0g/L（以K2SO4计）。钾盐对谷氨酸发酵的影响是：钾盐少时长菌，钾盐多时产酸。常用的钾盐有：磷酸氢二钾、氯化钾、磷酸二氢钾等,23,、微量元素：微生物需要量十分微少但又不可完全没有的元素称为微量元素。如：锰是某些酶的激活剂，有时可代替镁的作用，并与细胞渗的通透性有关，在谷氨酸合成途径中，草酰琥珀酸脱羧生成a一酮戊二酸是Mn2+存在下完成的。培养基中锰的浓度一般为13PPm(注有些厂家也有不添加锰的)。铁是细胞色素氧化酶、过氧化氢酶的成分，催化氧化还原反应，也是一些酶的激活剂。,24,4、生长因

14、子（生物素）凡是微生物不可缺少的微量有机物质通称为生长因子，如：氨基酸、嘌呤、蜜啶、维生素B。生物素是维生素B的一种，又叫维生H或辅酶R；其作用（1）影响谷氨酸生产菌细胞通透性；（2）影响菌体的代谢途径。生物素是一种弱酸，微容于水和乙醇，在酸性及中性水溶液中对热稳定。生物素作为酶的组成成分，参与糖、脂肪和蛋白质的代谢。,25,发酵中生物素亚适量的本质：在发酵过程中，控制生物素亚适量的本质是调节细胞膜的渗透性，当生物素控制亚适量时脂肪酸合成就不完全，导致磷酸合成不完全，而细胞膜是由磷脂双分子组成的，当磷脂含量减少到正常量的一般左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。,26,生

15、物素时谷氨酸生产菌必须的生长因子，它是种子和发酵培养基中不可缺少重要成份。在谷氨酸发酵生产中，生物素的浓度对菌体的增长和谷氨酸的积累有很大影响，菌体生长所需的生物素量比合成谷氨酸所需的生物素量高得多，发酵过程中的生物素量由“丰富向贫乏”过度，只有达到亚适量时，才能大量积累谷氨酸。如果生物素过量，则菌体大量繁殖而不产或少产谷氨酸，而产乳酸和琥珀酸，在生产上表现为长菌快，耗糖快，PH值低，液氨消耗多。若生物素不足，菌体生长不好，谷氨酸产量也低，表现为长菌慢，耗糖慢，发酵周期长。当供养不足，生物素过量时，发酵向乳酸发酵转换。供养充足，生物素过量，糖代谢倾向于完全氧化。,27,谷氨酸发酵最适宜的生物素

16、浓度因菌种、糖质种类、糖浓度和供氧情况的不同而不同，但它们的含量对促进谷氨酸菌的生长、繁殖和大量积累谷氨酸都有非常密切的关系。培养基中生物素含量一般在2.55.0ug/l，随着大种量的选用，一般都提到4.57.0ug/l。水：水是微生物生长必不可少的。主要生理功能：起到溶剂和运输的作用，营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成；参与细胞内化学反应；水是热的良好导体，有效的控制温度等等。,28,培养基组成及其作用,29,谷氨酸生产菌,谷氨酸生产菌的特征：1、细胞形态：棒状、椭圆、短杆。2、革兰氏阳性，无芽孢，不运动。3、需氧型4、生物素缺陷型5、平板菌落为圆形，乳白，表面光滑，半透明

17、，无粘性，略隆起。,30,谷氨酸菌体的形态及生长繁殖过程,谷氨酸菌种生长繁殖的过程：谷氨酸菌种的生长包括单个细胞生长和群体的增加，对于单个细胞来讲，一个细胞的大小质量，随培养时间延长而增大，但并不是无限至的增大，而是增大到一定程度就要分裂（繁殖），分裂后的细胞又变小，分裂方式是以一分二、二分四的对数成倍增长；对于群体而讲细胞的数量在一定范围内也随时间（培养）延长而增加，这就是群体生长。谷氨酸菌种在分批培养中，菌体细菌的浓度随时间而变化，我们常把菌体的生长分为四个阶段，即适应期、对数生长期、平衡期和死亡期。,31,、适应期细胞耗用本身物质进行代谢，为分裂做准备，细胞数量不增加。生产中要缩短适应期

18、。菌种接入新的环境，细胞耗用本身的贮藏的物质，进行代谢活动，单个细胞在长大，但还不进行分裂，细胞数量不变。适应期的长短取决于菌种的活力、接入量、培养基成分和培养环境，其一般12小时，在适应期中，菌体细胞对外界生理、化学因素的抵抗力很弱，应避免温度过高或过低，PH应控制中性或微酸性。、对数增长期菌体细胞通过适应期的调整，对内外环境的适应，以高速度进行分裂繁殖，即以对数增长。对数期种子健壮、活力旺盛，抵抗力增强，死亡率极少发生。,32,、平衡期通过对数生长期菌体活跃生长繁殖，引起营养物质的消耗，有害代谢物的积累以及PH、温度等环境条件的改变，对菌体生长不利。菌体生长速度开始逐渐放慢，死亡率逐步增加

19、，导致新增殖的菌数与死亡菌数趋于平衡，活菌数达到最大值，且保持相对稳定，对于生物素的利用少，菌体细胞多数向谷氨酸积累型转变，即转型期。、衰老期发酵周期的延长，发酵环境进一步恶化，细菌死亡率很快增加，总活菌数明显下降，直到最后基本全部死亡，此期谷氨酸的积累达到最大值。如下图：,33,微生物生长繁殖,细菌接种到均与的液体培养基后，细菌以二分裂发繁殖。在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变情况下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间里细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线叫生长曲线。,一般可以分为适应期，对数生长期，稳定生长期，衰亡期。,34,

20、微生物生长繁殖,细菌在生长和发酵时其形态发生变化。谷氨酸棒状杆菌为例：谷氨酸发酵过程的细胞可分为三阶段：长菌型细胞、转移期细胞、产酸型细胞。,35,谷氨酸代谢途径,（1）谷氨酸发酵的过程其实就是微生物的生化反应的过程，其生物合成包括糖酵解途径EMP、磷酸己糖途径HMP、三羧酸循环TCA、乙醛酸循环DCA、CO2固定反应等。（1）、发酵过程中，谷氨酸生产菌的生化生成谷氨酸的主要酶反应主要有：、谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的氧化还原共轭氨基化反应：谷氨酸脱氢酶 a酮戊二酸+NH4+NADPH2谷氨酸+H2O+NADP 式中：NADPH2还原性辅酶；NADP辅酶；、为转氨酶（AT）催化的转氨酶反应：

21、转氨酶 a酮戊二酸+氨基酸 谷氨酸+a酮酸、谷氨酸合成酶（GS）的催化反应 NADPH2 NADP a酮戊二酸+谷氨酰胺 2谷氨酸 谷氨酸合成酶,36,谷氨酸代谢途径,（2）谷氨酸生物合成的理想途径,EMP(为主）,HMP(26%）,CO2,CO2,CO2,CO2,NH4+,NADP NADPH NADPH NADP,（1）葡萄糖首先经EMP及HMP两个途径生成丙酮酸。其中以EMP途径为主，生物素充足时HMP所占比例是38；控制生物素亚适量，发酵产酸期，EMP所占的比例更大，HMP所占比例约为26。(2)生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA，另一部分经CO2固定反

22、应生成草酰乙酸或苹果酸，催化CO2固定反应的酶有丙酮酸羧化酶、苹果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。由上述谷氨酸生物合成的理想途径，由葡萄糖生物合成谷氨酸的最理想的反应方程式为：C6H12O6+NH3+1.5O2=C5H9O4N+CO2+3HO2由于1mol的葡萄糖可以生产1mol谷氨酸，因此理论糖酸转化率为81.7%。,37,谷氨酸代谢途径,（3）代谢途径：,38,培养基及设备的灭菌,第一节 培养基灭菌的目的、要求和方法第二节 湿热灭菌的理论基础 第三节 培养基灭菌的连续灭菌第四节 影响灭菌的因素第五节 发酵罐的灭菌第六节 补料液的灭菌,39,第一节 培养基灭菌的目的、要求和方法,一、定义 1、

23、培养基灭菌的定义是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。,2、灭菌与消毒的区别 灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。,40,二、培养基灭菌的目的 1、在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果：生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难杂菌会降解目的产物；杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；发酵时

24、如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。,41,2、工业上具体措施包括：1）使用的培养基和设备须经灭菌；2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；5）使用无污染的纯粹种子。,3、培养基灭菌的目的杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。,42,3、培养基灭菌的要求达到要求的无菌程度尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解培养基中不同营养成分间的相互作用；,43,4灭菌的方法化学法化学药品灭菌法物理法干热灭菌法湿热灭菌法射线灭菌法过滤介

25、质除菌灼烧灭菌,44,灭菌方法,采用方法要根据灭菌的对象和要求而定，见下表：,45,灭菌方法,续表,46,、湿热灭菌：是利用100以上加压的蒸汽使物料的温度升高而进行灭菌的方法。方法在生产中广泛使用，常用于培养基、消泡剂和种子罐、发酵罐、过滤器、玻璃器皿等设备。在同样温度和相同作用时间下，湿热灭菌法比干热灭菌法更有效，原因是湿热蒸汽不但穿透力强，而且还能破坏维持蛋白质空间结构和稳定性的氢键（细胞在60时510分钟即被杀死，酵母菌和真菌要在80被杀死，芽孢杆菌要在120时15分钟以上才被杀死）。连续加压蒸汽灭菌法：在发酵行业里也称“连消法”。此法仅用于大型发酵厂培养基灭菌。主要操作原理是让培养基

26、在管道的流动过程中快速升温、维持和冷却，然后进入发酵罐。如120125维持810分钟；135140维持58秒即可。,47,第二节 湿热灭菌,1.湿热灭菌的原理每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。,2.湿热灭菌中的相关定义 杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度

27、和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。,48,第三节 培养基连续灭菌,1，连续灭菌的设备,维持罐灭菌系统中的维持设备，主要是使加热后的培养基在维持设备中保温一段时间，以达到灭菌的目的，也称保温设备,49,喷射加热器可使料液和蒸汽迅速接触，充分混合，加热是在瞬时内完成的。,50,培养基连续灭菌流程,51,第四节 影响灭菌的因素,影响培养基灭菌的因素：培养基灭菌是否彻底影响因素很多，除了灭菌温度高低，时间长短外还取决于以下几点：1、培养基的PH：培养基PH越低灭菌时间越短，PH6时，死亡速度快，PH6-8时最不易死亡。2、培养

28、基成分：油脂、蛋白质、糖类都是传热的不良介质。这些有机物浓度较大时会在细胞的周围形成一层保护膜，使灭菌困难。3、培养基中的颗粒物质：瞬间消不透。4、泡沫：因为泡沫中的空气形成隔热层，影响热传递，不易杀死泡沫中的微生物。5、菌量：培养基中菌的接量影响灭菌，尤其芽孢菌。,52,第五节 发酵罐的灭菌,培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从排气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持1公斤，20分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。,53

29、,第六节 补料液的灭菌,在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属设备和管道都要经过灭菌,54,第三章 空气除菌的工艺及设备,本章讲述的内容,第一节 空气中微生物的分布和发酵工业对空气无菌程 度的要求 第二节 介质过滤除菌的机理第三节 空气过滤除菌流程第四节 应知应会,55,第一节 空气中微生物的分布和发酵工业对空气无菌程度的要求,一、无菌空气的概念发酵工业应用的

30、“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。,二、空气中微生物的分布空气中的含菌量随环境不同而有很大差异：一般干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少，而潮湿温暖的南方则含菌量较多；人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多；地面又比高空的空气含菌量多。各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量为103104个m3进行计算。,56,第二节 介质过滤除菌的机理,一、定义,孔,过滤除菌-利用有孔介质从气体中除去微生物,57,二、空气过滤器的功能一个空气过滤器的功能是从气体中去除污染物（微生物）

31、以使达到所需的 气体的无菌程度,过滤器的功能,过滤器经常被认为是一种简单的网或筛子，过滤/分离是在一个平面上进行的。,58,第三节 空气过滤除菌流程,59,空气过滤除菌流程的分析,发酵厂所使用的空气除菌流程，随各地的气候条件及设备条件不同而有很大的差别。要保持过滤器有比较高的过滤效率，应维持一定的气流速度和不受油、水的干扰。气流速度可由操作来控制；要保持不受油、水干扰则要有一系列冷却、分离、加热的设备来保证空气的相对湿度在5060的条件下过滤。,60,应知应会,空气净化过程为什么纪要空气冷却又要空气加热？压缩的空气温度较高，油水较多，所以首先要进行空气冷却，其目的是为了使空气中处于气体状态的水

32、分经过空气冷却器变成液体状态，从而使空气中液态的油水经油水分离器分离后排出以达到分离空气中油水的目的。而经冷却除油水后的空气在进入总过滤器之前又要进行加热，这是为了使空气中的残余水分尽可能处于气体状态。如果空气中未除尽的残余水分处于液体状态进入过滤介质，这样就会使过滤介质潮湿而降低透性，影响过滤效果。,61,目录,二,三,谷氨酸生产的工艺流程以及主要设备,一,谷氨酸的生产工艺原理及其应用,谷氨酸清洁生产,四,问题讨论,62,发酵工艺流程,发酵工艺流程：出发菌株原种一代斜面菌种二代斜面菌种三代或一级二级菌种发酵罐生产用菌种发酵通过发酵各种工艺参数的调控于控制经30小时发酵提取,63,发酵工艺流程

33、及现状,返回,二级种子罐工艺流程,64,发酵工艺流程及现状,发酵罐工艺流程,返回,65,温度对谷氨酸发酵影响,、发酵热：引起发酵过程中温度变化的原因是发酵过程中所产生的热量，收做发酵热，发酵热包括生物热、机械热、蒸发热和辐射热。、生物热在发酵过程中由于菌体的生长和繁殖及形成代谢产物，不断地利用营养物质，将其分解氧化获得能量，其中一部分能量用于合成高能化合物，供合成细胞物质和合成代谢产物，其余一部分则以热的形式散发出来。、机械热：机械搅拌通气发酵罐，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动造成液体之间液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。、蒸发热：通气时，引起发酵液水分的蒸发，被空气和蒸发水分带

34、走的热量叫做蒸发热。、辐射热：发酵罐温度与周围环境温度不同，发酵液中的部分热量通过罐体向外辐射，辐射热的大小，取决于罐内外温度差。冬天大些，夏天小些。,66,、温度对发酵的影响。菌体生长和代谢产物形成是由各种因素综合表现的结果。从酶反应动力学来看，温度升高，说明酶反应速度加快，生长代谢加快，产物生成提前，但由于菌体内的酶是蛋白质，很容易受热失活，温度越高失活越快，菌体越容易衰老，影响产物生成。因此大罐前期遇高温后，后期的耗糖慢、产酸低。谷氨酸产生菌的最适宜生长温度3235，形成代谢产物谷氨酸的温度是3538。在发酵前期长菌阶段和种子培养阶段应满足菌体生长最适宜温度。如温度过高，菌种容易衰老。生

35、产上表现OD增长慢、PH值高且不宜下降、耗糖慢、发酵周期长、谷氨酸生成少、严重时抑制菌体生长，遇到高温情况应及时降温，且采取小通风，必要时可补加玉米浆以促进生长，甚至需补种才能解决。发酵中后期，菌体生长基本停止，为大量生积累谷氨酸时期，需要适当提高温度，以促进谷氨酸生成。发酵罐温度的控制初始温度控制在34，以后每5小时提高1。0小时261026222628小时放罐 33.5 34 35 36 37 38 39 40以上,67,PH值对发酵的影响,、PH值对菌体的生长和代谢产物的积累有很大的影响。主要是：、PH值能影响酶的活性，使菌体代谢受阻；、PH值影响细胞膜所带电荷的改变，使菌体细胞膜的渗透

36、性改变，从而影响菌体对培养物质的利用和代谢产物的排泄。、PH值不同，往往引起菌体代谢途径的改变，使代谢产物的质量和比例发生改变。、发酵前期，幼菌体细胞对氮的利用率高，PH值变化波动大，要及时补充氮源，以免PH值下降过大。如果发酵前期PH偏低，菌体生长旺盛，消耗营养成分过快，菌体转入正常代谢，只长菌而不积累谷氨酸；如果PH过高，对菌体生长不利，糖代谢缓慢，发酵时间延长。谷氨酸发酵的关键酶一谷氨酸脱氢酶的最适PH值为7.0-7.2。、在发酵过程中，由于菌体对培养基中营养成分的利用和代谢产物的积累，使培养基的PH值不断变化，液氨用量大，PH值升高，液氨、糖被利用生成有机酸等产物，使PH值下降，谷氨酸

37、的形成也耗用大量的氨也使PH值下降，因此要不断地补充氮源和调节PH值。,68,通风与搅拌对发酵的影响,谷氨酸产生菌为兼性好氧性菌种，也就是说供氧不足时和供氧充足时均可生存，只是所产生的代谢产物不同，通风量小进行不完全氧化，葡萄糖进入菌体后，经糖酵解途径（EMP）产生丙酮酸，丙酮酸则经还原产生乳酸。如通风量过大，则进入菌体内的葡萄糖被氧化为丙酮酸以后继续被氧化成乙酰辅酶A进入三羧酸循环，生成a一酮戊二酸。只有在适当通风的条件下，a一酮戊二酸在NH+4供应充足的条件下，才能在谷氨酸脱氢酶的催化作用下还原氨基化形成谷氨酸，使谷氨酸大量积累。通风的实质除供氧外，还起到使菌体与培养基密切混合，保证代谢产

38、物均匀扩散。在发酵前期，菌体数量少，以生长繁殖为主，菌体内代谢途径是以糖酵解为主，因而通风量可以小些，而到12小时以后菌体大量增加，需氧量增加再加上代谢途径的加快，所以在发酵1-2小时后适当提高通风量对产谷氨酸有利。发酵生产中通常是三级或多级提风，依据菌体数量即OD值的变化而提风。搅拌可以提高通气效果，是空气经过搅拌叶打碎变成小气泡，以增加气液接触面积，提高溶解氧的效率。发酵过程中，通风和搅拌必须密切配合，才能取得好的效果。,69,泡沫对发酵的影响,、泡沫产生等原因：搅拌、通风强度、培养基的性质（糖蜜、玉米浆以及糖液等质量）、罐压的高低、发酵罐的结构、工艺类型、菌种的活力以及菌株的种类等。、发

39、酵生产中，泡沫过多会带来危害：、泡沫过多会引起大量发酵液逃出，造成浪费和环境的污染。、泡沫升到罐顶从轴封渗出易造成染菌。、泡沫占用空间大，减少发酵罐的装填系数，降低设备利用率。、泡沫过多还影响氧的传递。、影响通风与搅拌的效果，增加能源消耗。、代谢气体不能及时排出会影响到菌体的呼吸，使代谢不正常，甚至使菌体自容。过多的泡沫也给提取带来困难。因此，发酵过程中控制泡沫的过多产生是非常重要的。,70,、发酵生产过程中消除泡沫的方法及注意事项：机械消泡器消泡和化学消泡剂消泡即植物油、矿物油和合成消泡剂（聚醚类）。消泡剂有消除泡沫的作用，但也会使菌体团聚、降低培养基的溶解氧和通风效果，影响菌体生长和代谢产

40、物的积累，如加入过多还对谷氨酸提取分离不利。因此实际生产中即要控制泡沫过多又要限制加入消泡剂的用量，即如何打到一个最佳结合点才有利于发酵。、消泡剂的消毒机理和消泡剂的选用原则：机理：由于消泡剂本身的表面涨力较低，当消泡剂接触到泡膜表面时，使泡膜局部等表面涨力降低，力的平衡被打破，产生泡泡合并，最后导致泡沫破灭。消泡剂选用原则：、必须是表面活性剂，具有较低的表面涨力。分散性能好，在水中的溶解度极小。、无毒，使用方便。,71,(1)生物素用量：因为采用大种量、中糖再补糖工艺，要求生物素的供量略高于常规低糖发酵，以培养较多些菌体转化成产酸型细胞，也称超亚适量法。控制总OD值净增0.8左右。要考虑糖液

41、质量的差异来确定其具体用量，要求糖液透光好，质量好，配料准确。定容稳定，一保证出糖浓度和生物素含量的确定。(2)菌种活力：为保持菌种在发酵后期的活力，除选用高产酸、高活力的谷氨酸产生菌外，从斜面、一级至二级种子的培养温度均应控制在33-34，并控制总OD，以保证足够的高活力的产酸型细胞。,72,谷氨酸发酵控制要点,（3）温度、PH控制：温度采用三级控制，0-12h以33.5-36为宜，12-28h以 36-39为宜，28h后可提高到39-40.5，后期适当提高温度可以提高酶的活力，并使菌体内谷氨酸向胞外溢出。发酵前期PH控制在7.0-7.1，发酵后期稍微降低，放罐是PH6.5-6.6，以利于提

42、取。（4）风量控制：采用梯形控制通风，两头小，中间大。（5）糖耗速率控制：谷氨酸发酵过程中前期糖耗不宜过快，进入产酸期，其它因素控制跟得上，可加快躺好速率。,返回,73,染菌问题,谷氨酸发酵车间最为常见的问题，是不明原因的杂菌或噬菌体污染和原料变质，防治杂菌和噬菌体的污染要从整个空气系统的管理、设备和培养基灭菌的彻底程度、消除灭菌死角、发现并避免整个无菌空间的渗漏、加强生产车间室内外设备设施和空间的消毒、避免误操作、控制活菌体的排放以及对带菌样品和带菌尾气的消毒灭菌等各个方面进行管理；预防原料变质要从保存方式方法、控制存放时间、做好存放容器和输送管线的清洁工作以及提高原料自身防腐能力等方面做好

43、管理工作。,74,谷氨酸应知应会（2）,为防止噬菌体感染，应采取哪些措施？1、严禁活菌排放。2、严格要求对染菌罐处理。3、提取废液一个远离发酵。4、灭菌彻底，所有设备死角都要消到。5、加大环境消毒。6、接种前后要消毒，保证接种时不染菌。7、好种子液的检查，保证种子无污染。8、连消对物料灭菌要彻底，不进生料。,75,谷氨酸应知应会（3）,常用消毒剂的使用标准：1、高锰酸钾：0.1-0.25%2、漂白粉：2-5%3、来苏尔：3-5%4、甲醛：1-3%（杀菌能力强，6-12小时，可以杀死所有芽孢细菌，用量10mt/m3。5、乙醇：70-75%6新洼尔灭：0.1-0.25%7、碳酸：5%8、过氧乙酸溶

44、液：14-16%（配制方法：冰醋酸100ml、硫酸（98%）20ml）9、双氧水：30%（静量48-72小时，倒入棕色瓶保存。）,76,染菌分析,杂菌污染：杂菌污染是指在发酵过程中，生产菌以外的其它微生物侵入了发酵培养基，以至于造成严重的后果，因此，发酵生产必须防止杂菌的污染。、环境中杂菌存在的程度：大气中：103-104个/M3；一般水中：103-104个/ml；：污水中：105-106个/ml；、杂菌污染的原因：设备有死角或渗漏带菌（管路穿孔，阀门渗漏，）；培养基灭菌不透和操作不当带菌；空气系统有菌；环境不清洁带菌；种子带菌等。、为何要防止杂菌污染：消耗原辅材料，使收率下降；生产有害物，抑

45、制目的物的生长；分解目的物；生产菌逐步被消灭，造成生产停产。、防止杂菌污染的方法：严格无菌操作，防止种子带菌；消除设备死角、渗漏、污垢和设备的清洗工作；提高空气系统净化能力；严格培养基灭菌操作；保持环境的净化；。、杂菌污染的检查：无菌检查；镜检；观察糖消耗的变化（培养基不接种）；通气量的变化；PH值高低的变化；湿菌体量的增值变化。,77,染菌分析,噬菌体是病毒的一种，即微生物的病毒。噬菌体无细胞结构，个体极小，体积只有细胞的千分之一左右，必须借助电子显微镜才能看到。它具有非常专一的寄生性，不能脱离寄主而自行生长繁殖，且在活菌体中才能生长。只要有或菌体的地方，就有噬菌体的存在。因此发酵过程中要杜

46、绝活菌排放，要树立排放活菌体就是犯罪的思想。,78,5.1.11 噬菌体的感染途径和感染规律,噬菌体在自然界中分布很广，在土壤、污水、腐烂的有机物和大气中均有存在，凡是有寄主细胞的地方一般都存有它们的噬菌体，发酵车间、提取车间及周围更有机会积累噬菌体。造成噬菌体污染必须具备三个条件：有噬菌体；有活菌体；有使噬菌体与活菌体接触的机会和适宜条件。活菌体的排放点：、发酵罐、种子罐取样口；、发酵罐、种子罐排气口，、一级钢瓶接种的残留液、发酵放罐、种子罐接种后，管壁及管道的残留液；、分析室对各测试样品、镜检样品的残留液。,79,染菌分析,噬菌体图片（病毒）,噬菌体图片,噬菌体的感染过程包括5个阶段：吸附

47、、侵入、增殖、成熟、裂解,80,染菌分析,污染噬菌体现象：、OD值急剧下降；、PH上升到8.0以上且不下降；、耗糖缓慢或停止；、泡沫大，粘度大甚至胶状拔丝；、发酵周期逐渐延长，谷氨酸产量低；、镜检：菌体减少缺乏八字排列，革兰氏染色后呈红色碎片，丝拉网状，看不到完整菌体；、双层平板有噬菌斑，摇瓶发酵清而稀；、提取发酵液发红发灰，残糖高、泡沫大、粘度大、难中和，易出B一型结晶，谷氨酸呈泥状或糊状，过滤难，收率低，谷氨酸结晶质量差，色素深发粘。,81,目录,二,三,谷氨酸生产的工艺流程以及主要设备,一,谷氨酸的生产工艺原理及其应用,谷氨酸清洁生产,四,问题讨论,82,谷氨酸清洁生产,1、无菌控制2、

48、各岗位清洁生产工作,83,无菌控制,、车间环境环境消毒、发酵车间外环境 轮换使用甲醛、漂白粉溶液、新洁而灭和次氯酸钠喷洒。、发酵车间内环境 轮换使用甲醛、漂白粉溶液、新洁而灭和次氯酸钠喷洒。、发酵车间内、外环境 每天清晨清扫干净，车间内清扫干净后用药水拖地一次。、勤擦设备、门窗，保持干净。、对发酵车间周围、发酵排气口、空气进风口等处每周两次取样进行环境噬菌体普查。、发酵罐的尾气和外溢泡沫以及取样液应严格管理。a、发酵罐尾气和外溢泡沫集中到定期加甲醛或液碱的尾气处理罐，蒸汽加热保持60-70进行杀菌处理。b、取样液直接进入加有漂白粉或苯酚溶液的取样漏斗内杀菌，满后排至用蒸汽加热保持60-70的废

49、液处理罐再次杀菌处理，定期排放。,84,无菌控制,、车间设备定期严格检查，消灭死角和防止设备渗漏，铁罐还应定期做好罐内除锈工作。、车间污染罐的处理：用PH 11-13的碱水煮罐，通常夹层加热至100以上，开搅拌10-15分钟，再压入另一只罐重复使用（如另一只罐也有污染），然后冷却至50左右排放。,85,谷氨酸各岗位清洁生产,清洁生产工作：应随时保持现场设备、地面、地沟卫生，垃圾要常清理，所有设备及物料管道的外表以及设施内外壁要保持清洁，见本色（含防腐色），总的要求是“窗明几净”，按规定时间对发酵车间室内外空间，喷洒消毒液，以减少微生物的滋生，每周对发酵车间室内指定地点进行两次无菌检测，按规定完

50、成以下清洁生产工作后，必须填写记录，建立台帐，各岗位详细的清洁生产内容如下：,86,谷氨酸清洁生产-1.菌种岗位,1.1 配料间、办公室、卫生间、冰柜间、库房等处，每月进行一次大扫除，每天对地面、桌面及墙面的下半部，用0.5新洁尔灭（苯扎溴铵）溶 液擦拭两次，每天夜间用紫外线照射40min。1.2 无菌室使用五天后，倒换一次，并进行熏蒸，摇床间和无菌室用25g高 锰酸钾、50ml甲醛进行熏蒸或者对甲醛直接加热后熏蒸；缓冲间用量可 以减半，此项工作由当班人员完成。1.3 当天无菌室的工作完成后，用毛巾浸渍0.5新洁尔灭溶液，将无菌室 的屋顶、墙壁、地面等彻底擦拭一遍，不留任何死角，然后用紫外线灯