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1、1,Calcium Homeostasis and Calcium Overload in Cell(细胞内钙稳态与钙超载)Pathophysio.Dep.Of SDU袁中瑞,2,In all eukaryotic cells,the cytosolic concentration of Ca2+ions(Ca2+C)is tightly controlled by interactions among transporters,pumps,channels and binding proteins.Finely tuned changes in Ca2+C modulate a variet
2、y of intracellular functions ranging from muscular contraction to secretion,and disruption of Ca2+handling leads to cell death.,3,细胞内钙稳态调节(Calcium Homeostasis in Cell 细胞内钙超载(calcium overload in cell)线粒体与钙(mitochondria and calcium),4,一、Calcium Homeostasis in Cell,5,Fig.1.Ca2+distribution in the cell.
3、High and low Ca2+domains are marked with orange and blue,respectively.(From:Calcium signaling and apoptosis,Biochem Biophys Res Commun.2003 May 9;304(3):445-54),6,7,(一)钙平衡1、钙瞬变值 Ca2+EC:110 mM Ca2+C:0.110M细胞内钙:44%存于胞内钙库（肌浆网/内质网）；细胞内游离钙仅0.005%生理性钙瞬变值：即细胞内钙浓度的增加，平均介于0.110M之间。钙荧光探针（indo-1、fura-2、fluo-3
4、AM 等等）以及Aequorin（水母发光蛋白）、GFP-based fluorescent Ca2+probes（such as cameleons and pericams）等。,8,9,10,2.钙移动的决定因素,钙的平衡和钙的瞬变值依赖于两组蛋白质 一组负责钙的输入和激活钙释放 另一组负责钙的输出和摄取回收(1）Ca2+进入胞液的途径(2）Ca2+离开胞液的途径,11,(1）Ca2+进入胞液的途径,Ca2+进入胞液是顺浓度梯度的被动过程 细胞外Ca2+跨膜入胞细胞内Ca2+释放 细胞内Ca2+增加主要取决于内Ca2+释放 另外Ca2+还可通过Na+-Ca2+交换蛋白进入胞液,12,1）
5、细胞膜Ca2+通道,电压依赖性Ca2+通道（voltage-dependent calcium channel，VDC）：其活动受膜电压变化的影响 L-型(Lasting-,持续型)：特点是开启后产生持续Ca2+内流；（*可被钙通道阻滞剂所阻断）T-型(Transitory,短暂型)：开放时间短暂，很快失活；N-型(Neuronal,神经型)：开放时间介于L、T 型，只存在于某些神经元上。,13,受体操纵性钙通道(receptor-operated calcium channel，ROC)：a 配体与受体结合后直接调节钙通道开放；b 配体与受体结合后G蛋白偶联调节钙通道开放；c 受体与配体结合
6、后G蛋白偶联产生第二信使修饰VDC(可能是L-型VDC)，调节VDC对Ca2+的通透性。,14,eg:1受体激动剂G蛋白 AC cAMP PKA 磷酸化钙通道，胞外Ca2+内流。,15,2）细胞内贮存钙释放的机制,细胞内游离Ca2+主要贮存于内质网(ER)肌浆网(SR)中，经Ca2+释放通道释放。1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)敏感钙池:受IP3受体系统调控 IP3不敏感钙池:受ryanodine受体系统调控,16,IP3受体系统,当IP3与IP3受体(IP3R)结合开放钙通道，ER/SR中的钙释放入胞浆中IP3R-type介导的Ca2+释放依赖于一定浓度的胞浆Ca2+（Ca2+i），呈钟形反
7、应(bell-shaped response);IP3R-type,则更接近线性反应。IP3R系统释放细胞内钙受许多因素影响：Ca2+i；碱性环境中Ca2+释放增加 K+通过K+通道进入钙池，进而促进Ca2+释放 肝素是IP3R的持异性拮抗剂,17,ryanodine受体系统,在多种细胞内普遍存在ryanodine受体（以下简称RyR）调节IP3不敏感钙池内钙的释放。现知RyR至少有3种亚型:RyR1存在于骨路肌SR上，有50325037个氨基酸残基；RyR2存在于心肌上，有4967个氨基酸残基，RyR3存在于非肌性细胞上，比前两者小得多，只有641个氨基酸残基。,18,Ca2+与RyR上的C
8、a2+结合位点结合，而触发SRER释放Ca2+。这种Ca2+诱发Ca2+释放(calcium induced calcium release，CICR)的正反馈机制是RyR系统触发Ca2+释放的特征。普鲁卡因、钌红为RyR的拮抗剂，咖啡因、ryanodine为其激动剂。,19,3）Na+-Ca2+交换蛋白,Na+-Ca2+交换蛋白:为双向性离子转运器，催化Na+从膜的一侧转运到另一侧，以交换Ca2+的相反方向的运动。3 Na+:Ca2+，是产电的。,20,Na+-Ca2+交换是利用业已建立起来的离子的电化学位能，即由Na+-K+ATPase 建立的胞内外Na+梯度，而不直接利用ATP。Ca2+
9、流动的方向取决于Na+梯度的方向，只是后者的方向相反。Na+-Ca2+交换的可逆电位约在15mV到 30mV之间。膜电位负于可逆电位时，Na+内向和Ca2+外向运动。反之，膜电位正于可逆电位，也即膜去极化，则Na+外向而Ca2+内向运动。,21,(2）Ca2+离开胞液的途径,Ca2+离开胞液是逆浓度梯度、耗能的主动过程:1)Ca2+-ATP酶 2)Na+-Ca2+交换蛋白,22,1)Ca2+-ATP酶,心肌细胞主要依靠Ca2+-ATP酶转运Ca2+回到细胞内贮存系统或移出细胞外恢复细胞内的Ca2+稳态。Ca2+-ATP酶有10个螺旋疏水节段，称为M1M10。在M4，M5，M6，M8形成的一个通
10、道中有2个对Ca2+具有很高亲和力的结合位点。这10个螺旋疏水节段与3个细胞质亲水环相连接。亲水环包含ATP结合位点和磷酸化位点。,23,细胞膜Ca2+-ATP酶:利用ATP提供的能量逆细胞膜两侧高的电化学梯度泵出Ca2+，其活性受钙调蛋白、PKA、PKC等因子的调控。细胞器（内质网及肌浆网）钙ATP酶：位于细胞内钙贮存系统（细胞器）膜上，蓄积Ca2+到细胞器腔中。心脏和血管的肌浆网Ca2+-ATP酶构型具有特殊性，其功能调节依赖于一种辅助性跨膜蛋白-受磷蛋白。,24,受磷蛋白（phospholamban,PLN),受磷蛋白由五个亚基(分子量6 KD)组成，每个亚基均可磷酸化，有两个不同的磷酸
11、化位点，分别对cAMP依赖的蛋白激酶A(PKA)和另一种钙调蛋白依赖的蛋白激酶起反应。受磷蛋白的磷酸化肌浆网Ca2+-ATP的跨膜结构改变，Ca2+-ATP的泵能力随后被激活。（HF）NE，-R PKA:Pi化PLN,非Pi 化PLN 心肌舒张功能障碍,25,2)Na+-Ca2+交换蛋白,在细胞内高钙时作为钙输出系统工作Na+-Ca2+交换其转运Ca2+的速率高，约为钙泵的几十倍。,Ca2+,3Na+,胞外,胞内,26,27,举例：给予-激动剂心肌收缩力，舒张速率,L-VDC,PLN,Ca2+-ATPase,Ca2+-ATPase,28,二、细胞内钙超载,29,Temporally and s
12、patially organized increases in Ca2+c,Ca2+m,and Ca2+n represent one of the most commonly used intracellular signals.However,prolonged changes in Ca2+distribution including an elevation in Ca2+c,Ca2+m,and Ca2+n and a Ca2+decrease in ER trigger a variety of cascades that lead to cell death.,30,1972 年S
13、hen 和Jennings发现犬心脏冠状动脉短暂闭塞后复灌可加速细胞内Ca2+的积聚,并首次提出钙超载之说,此后,Ca2+在再灌注损伤中的作用一直成为人们研究的重点。各种原因引起的细胞内钙含量异常增多并导致细胞结构损伤和功能代谢障碍的现象称为钙超载(calcium overload)。,31,Possible Correlation of Calcium Overload with Cytotoxicity,Increasing of Ca2+C,calcium overload,is the primary cause of cytotoxiceffects,including necros
14、is and apoptosis,of toxicants and stress induced responses.eg.Cardiotoxicity:oxidative stress,ischemia-reperfusion;Hepatotoxicity:CCl4Immunotoxicity:glucocorticoidsKidney toxicity:oxidative stress,heavy metalsNeurotoxicity:lead,ischemia,excitatory amino acid,32,Role of Calcium Overload in Cellular I
15、njury,Relation of Ca2+C to early reversible injury-bleb and cytoskeletalalteration-cell volume changes()-nuclear changes()-condensation of mitochondriaRelation of Ca2+C to irreversible injury-swollen mitochondria-DNA strand break,33,(一）Ca2+超载的的形态学资料,电镜：大多内流的Ca2+都局限于mito基质内的致密体内（细胞Ca2+超载的显示器）,mito内Ca
16、2+的大量内流是再灌注收缩早期的特征现象。形态学变化：缺血40 min时（肌纤维水肿、mito肿胀,无Ca2+流入mito的迹象）；再灌注时:心肌细胞超微结构的损伤（收缩带的形成、心肌纤维的断裂和肌纤维膜的破坏,细胞急剧肿胀,并出现mito内致密体）用Ca2+荧光探针表明：心肌缺血90 秒（已发生细胞内Ca2+）；短暂缺血后再灌注早期（细胞内Ca2+暂时）；缺血30 分钟后复灌（渐进的稳定的Ca2+）。,34,（二）Ca2+超载的机制,1、N a+-Ca2+交换异常 2、内源性儿茶酚胺释放增多 3、生物膜损伤,35,1.N a+-Ca2+交换异常,在心肌缺血和再灌注时，Na+-Ca2+交换蛋白
17、以反向转运增强，成为Ca2+进入细胞的主要途径。,胞外,胞内,Ca2+,3Na+,36,（1）细胞内高Na+对Na+-Ca2+交换蛋白的直接激活,缺血：缺氧 ATP Na+-ATPase失灵 细胞内Na+浓度升高 再灌注：氧，ATP 激活Na+-Ca2+交换蛋白 细胞内高钠 Na+-Ca2+交换蛋白以反向转运的方式加速Na+向细胞外转运，同时将大量Ca2+运入胞浆。,37,（2）细胞内高H+对Na+-Ca2+交换蛋白的间接激活 Na+-H+交换蛋白,细胞膜Na+-H+交换蛋白是离子逆向转运蛋白 Na+-H+交换蛋白主要感受细胞内H+浓度的变化，利用H+电-化学梯度作为动力来源，以1：1的比例将
18、细胞内H+排出细胞，而将Na+摄入细胞，这是维持细胞内pH稳定的重要机制。,Na+,H+,胞外,胞内,38,缺血 无氧代谢 细胞内、外H+浓度 再灌注 胞外H+，胞内H+仍高跨膜H+浓度梯度形成激活Na+-H+交换蛋白促进细胞内H+排出，而细胞外Na+内流；如果内流的不能被Na+-ATPase充分排出，细胞内高钠就可继发性激活Na+-Ca2+交换蛋白，促进Ca2+内流，加重细胞内Ca2+超载。动物实验中应用Na+-H+交换抑制剂可减轻心肌缺血再灌注损伤，但在近年临床患者的实验中，Na+-H+交换抑制剂并未对高危患者显示出明显的保护作用，提示还有其他机制介导再灌注性心肌损伤。,39,2.内源性儿
19、茶酚胺释放增多,生理条件下，心功能主要受肾上素能受体调节，1肾上素能受体的调节作用很小。但缺血-再灌注损伤时，内源性儿茶酚胺释放增多，1肾上素能受体的调节也相对起重要作用。,40,1)1肾上素能受体,1肾上素能受体激活G蛋白-磷脂酶C（PLC）介导的细胞信号转导通路，促进磷脂酰酯醇（PI）分解，生成三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DG）。IP3与肌浆网上的IP3受体结合促进钙池内钙释放；DG进一步激活PKC，而PKC可促进Na+-H+交换，进而增加Na+-Ca2+交换，使胞浆Ca2+浓度升高,41,2)肾上素能受体兴奋,肾上素能受体兴奋可通过增加L型Ca2+通道的开放促进Ca2+内流:1受体激
20、动剂心肌细胞后，通过G蛋白偶联激活ACcAMP，激活PKA 磷酸化L型钙通道，使其对Ca2+通透性增高，胞外Ca2+内流,42,在缺血前或再灌注前应用Ca2+通道阻滞剂阻断Ca2+内流，可见细胞坏死程度减轻，提示Ca2+通道是细胞外Ca2+进入胞浆造成Ca2+超载的途径之一。但在再灌注后应用Ca2+通道阻滞剂往往不能有效的防止细胞内Ca2+浓度升高。,43,3.生物膜损伤,细胞膜和细胞内膜性结构是维持细胞内、外以及细胞内各间区离子平衡的重要结构。生物膜损伤可使其通透性增加，细胞外Ca2+顺浓度差进入细胞，或使细胞内Ca2+分布异常，加重细胞功能紊乱与结构破坏。,44,Cellular memb
21、rane,Cellular membrane,PLA2,lipid break up,Ca2+,normal,无Ca2+,再灌注,glycocalyx,glycocalyx,(1)Ca2+反常,45,(2)自由基损伤膜，膜结构破坏(3)肌浆网膜损伤：Ca2+-ATP酶功能抑制，使肌浆网摄Ca2+减少(4)线粒体膜损伤：抑制氧化磷酸化，使ATP生成减少，细胞膜和肌浆网膜Ca2+-ATP酶能量供应不足，促进Ca2+超载的发生；细胞膜Na+-ATP酶能量供应不足，细胞内Na+含量明显增高，激活Na+-Ca2+交换蛋白，Ca2+内流增多。,46,（三）钙超载引起再灌注损伤的机制,1.激活多种酶：Ca2
22、+i 磷脂酶 细胞膜及细胞器膜的损伤 花生四烯酸（arachidonic acid,AA)环氧合酶：PGI2，PGD2，PGE2，TXA2 脂氧合酶：白三烯（LT）：LTB4、LTC4 LT：趋化性（WBC），激活M 细胞色素P-450加单氧酶：抑制钠泵的代谢产物Ca2+i 蛋白酶 细胞膜和结构蛋白的分解,AA,47,Ca2+iATPase ATP 的消耗Ca2+i核酶（ribozyme）染色体的损伤 2.促进氧自由基生成：次黄嘌呤 Ca2+i XO 黄嘌呤 自由基 尿酸3.再灌注性心律失常 Ca2+i Na+-Ca2+交换 一过性内向电流 在AP后形成延迟后除极 心律失常,48,4.肌原纤维
23、过度收缩（收缩带）Ca2+i 肌原纤维过度收缩（收缩带）肌纤维断裂 Mechanism:缺血期堆积的H+迅速移走，抑制作用 再灌注，重新获得ATP+Ca2+i 肌原纤维过度收缩/甚至是不可逆性缩短 损伤细胞骨架结构心肌纤维断裂,49,实验证据：单个心肌细胞内注射Ca2+细胞的过度收缩结扎猪冠状动脉前降支45min，恢复血流，经冠脉给与直接抑制肌原纤维收缩的药物BDM 再灌注后心肌梗死的面积比对照组减少50%5.线粒体功能障碍 ATP生成不足；启动细胞的死亡是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超载伴随着缺血再灌注损伤,50,三、线粒体与钙,线粒体被认为是细胞内最大的钙池之一，生理状态下，可以有效地缓
24、冲细胞内Ca2+浓度变化。心肌缺血后，其损伤的发生、发展与线粒体内Ca2+稳态失调关系密切。目前研究证实，在多数条件下，线粒体内Ca2+的过度聚集使膜通透性转运孔（mitochondrial permeability transition pore,MPTP）开放，引起线粒体功能障碍和与启动细胞死亡事件相关蛋白的释放，启动细胞死亡。,51,线粒体的结构：由内外两层膜封闭，包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区隔。在肝细胞线粒体中各功能区隔蛋白质的含量依次为：基质67%，内膜21%，外膜8%，膜间隙4%。线粒体结构模型,52,（一）线粒体内Ca2+的转运,1.线粒体内Ca2+与钙微区 钙微区（c
25、alcium microdomain）是指当单个钙释放通道或小群通道开放时，形成通道口附近的局部Ca2+浓度升高。少量激活内质网上的IP3型钙释放通道胞浆内钙微区周围的线粒体可感受到钙微区线粒体内Ca2+浓度快速上升。mito-内质网 80nm线粒体内Ca2+聚积影响内质网对Ca2+的摄取与释放，两者之间可进行Ca2+循环。而且，线粒体对内质网Ca2+释放有调节作用。,53,2.线粒体内钙离子的转运方式及调节,产电的顺向转运Uniporter.两种交换：3 Na+/Ca2+逆向转运，2H+/Ca2+逆向转运.,54,(1)the mitochondrial Ca2+uniporter,MCU,
26、is on the inner membrane,the Pathway of mito taking up Ca2+.Act like a channel,opening with increased probability once the local Ca2+c rises.Low-affinity:its activity would be extremely low at rest.Taking up Ca2+at the expenses of m(-150200 mV).可被钌红(ruthinium red)和La3+特异性抑制.,55,MCU starts to be acti
27、vated at 25M of local Ca2+c.At the average,Ca2+c is near 10M during activation，but higher Ca2+concentrations(10100M)can be reached at local cells spots,at high Ca2+microdomains.The activity of the MCU is very small or absent at cytosolic Ca2+below 0.5M,whereas its activity increases dramatically alo
28、ng the micromolar range,reaching saturation above 100M.Global Ca2+c increasing able to activate MCU can also be reached during Ca2+overload under pathological circumstances and do usually drive to mitochondria-triggered cell death.,MCU,56,（2)Pathway of calcium effluxing from mitochondria,Mito 3Na+/C
29、a2+exchanger,is predominant in heart and brain mitochondria and is electrogenic Ca2+/2H+exchanger：is nonelectrogenic and is present in liver and kidney mitochondria MPTP a regulated pore,which has two different open states and can open transiently.During physiological Ca2+signals,an increase in Ca2+
30、m is followed by a transient release of Ca2+m,57,Activation of MCU occurs when the Ca2+c in the neighbourhood of the mitochondrial membrane increases to the micromolar range.Under these conditions,the rate of Ca2+entry through the uniporter exceeds that of Ca2+extrusion through the exchanger,leading
31、 to a fast increase in Ca2+m.,Summarize,58,是线粒体的钙超载而不是细胞浆的钙超载伴随着缺血再灌注损伤,（二）线粒体钙超载与细胞损伤,59,60,1.线粒体钙超载使ATP合成障碍,生理状态下，Ca2+m 调节mito产能细胞受到生理剌激时,Ca2+由钙库释放线粒体产生短暂而局部的Ca2+上升线粒体脱氢酶活性增加。细胞缺血 Ca2+m增加，线粒体脱氢酶活性增加，产生更多的ATP以满足细胞需要。Ca2+m过度持续增加,可引起线粒体膜通透性转运孔(MPTP)不可逆过度开放，小于1 500道尔顿的分子或离子可以通过线粒体内膜，H+由此进入线粒体基质引起ATP合成
32、障碍。,61,化学渗透学说：认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是H+的跨膜梯度.这一学说得到公认并获得了1978年诺贝尔奖。(呼吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质内的H+逆浓度梯度泵出线粒体内膜;H+不能自由透过线粒体内膜在线粒体内膜两侧形成质子跨膜梯度pH及跨膜电位线粒体外的H+可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着H+浓度梯度进入线粒体基质中，H+顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于ATP的合成),62,2.线粒体钙超载导致MPTP不可逆过度开放,MPTP是由电位依赖性离子通道，是孔蛋白、腺苷酸移位酶及亲环素D复合物在内外膜交接处构成的一种复合结构。MPTP在生理状态下呈
33、间断性开放，且具有可逆性，能造成m的降低，线粒体内Ca2+减少和内部产生自由基减少，使细胞维持正常的生理功能。若MPTP不可逆过度开放可导致m崩溃，呼吸链解偶联，ATP合成停止，线粒体基质外流，还原性谷胱甘肽耗竭，超氧阴离子大量产生，最终导致基质渗透压增高，线粒体内腔肿胀。,63,线粒体钙超载产生缺血再灌注损伤的重要机制之一就是线粒体基质Ca2+浓度持续升高致使线粒体内膜MPTP不可逆过度开放,64,1）MPTP开放引起细胞色素C释放细胞死亡：在细胞色素C含量丰富的细胞，通过快速凋亡机制包括由ApaF1(凋亡促进因子-l)介导的凋亡过程。释放的细胞色素C参与激活凋亡的酶通路，未释放的细胞色素C
34、用于维持电子传递和氧呼吸，为凋亡进程提供ATP。由于线粒体MPTP开放，细胞色素C大量释放，ATP产生骤减，无法维持供能，细胞走向坏死。,65,Fig.2.Temporal and spatial organization of mitochondrial depolarization and cyto c release induced by C2-ceramide+Ca2t and tBid.Fluorescence imaging of DWm was carried out simultaneously with cyto c distribution in cyto c-GFP-ex
35、pressing and TMRE-loaded HepG2 cells.Sequentialfluorescence images are shown as green(Fcyto c-GFP),red(FTMRE)overlays.Depolarization appears as a loss of the red fluorescence,whereas cyto c release appears as a loss of the green fluorescence.Cyto c-GFP was expressed only in three cells that are show
36、n in the upper right quadrant.Permeabilized cells were pretreated with C2-ceramide(40 lM for 5 min)before addition of Ca2t(50 lM CaCl2)and,subsequently,tBid(25 nM).In the absence of C2-ceramide,a relatively small Ca2t-induced depolarization and no cyto c-GFP release were observed(not shown).The Ca2t
37、-induced mitochondrial depolarization initiated in discrete subcellular regions and propagated as waves through cells(direction of the wave is marked by the white arrow in the upper left image).Time courses of the fluorescence changes are plotted in the graph.,66,67,2）MPTP-dependent intermitochondri
38、al calcium signaling,Ca2+m the opening of the MPTP release of the accumulated Ca2+subsequently taken up by adjacent mitochondriaThis mechanism may result in a regenerative response that spreads throughout the entire mitochondrial population of the cell.Notably,MPTP-dependent intermitochondrial calci
39、um signaling has been reported to recruit mitochondria to the apoptotic process.,68,3.线粒体钙与活性氧,活性氧分子ROS:包括超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基。线粒体是细胞产生ROS的主要场所：complex，Superoxide；Mn-SOD H2O2 or Superoxide+NO ONOO-ROS的产生与线粒体内Ca2+的聚积有关:mito Ca2+MPTP开放mthem-dependent complex III-mediated ROS formation.mito Ca2+mNOSNO ONOO-
40、ROS 细胞损伤：脂质过氧化细胞膜的通透性 细胞内Ca2+超载。由此可见，线粒体内Ca2+超载导致ROS产生，ROS又促使细胞内Ca2+超载的发生。,69,70,References:,1.Cell Calcium,34(2003)399405:Ca2+signalling in mitochondria:mechanism and role in physiology and pathology.2.Cell Calcium,40(2006)513525:Calcium microdomains in mitochondria and nucleus3.Journal of Physiolo
41、gy(2000),529.1,pp.5768:Mitochondria and calcium:from cell signalling to cell death,71,细胞内钙稳态与钙超载,基本要求：1.熟悉细胞内钙超载的发生与引起心肌缺血再灌注损伤的机制。2.掌握线粒体内钙超载引起心肌缺血再灌注损伤的机制。3.了解细胞内钙稳态调节机制。,72,氧化磷酸化的偶联机制-目前多数人支持化学渗透学说(chemiosmotic hypothesis)，其基本观点是：1.线粒体的内膜中电子传递与线粒体释放H+是偶联的，即呼吸链在传递电子过程中释放出来的能量不断地将线粒体基质内的H+逆浓度梯度泵出线粒
42、体内膜，这一过程的分子机理还不十分清楚。2.H+不能自由透过线粒体内膜，在线粒体内膜两侧形成一个质子跨膜梯度pH，内膜外侧+，内膜内侧-，这就是跨膜电位。底物氧化过程中释放的自由能就储存于和pH中，若以P表示总的质子移动力，那么P=-59pH 3.线粒体外的H+可以通过线粒体内膜上的三分子体顺着H+浓度梯度进入线粒体基质中，这相当于一个特异的质子通道，H+顺浓度梯度方向运动所释放的自由能用于ATP的合成，寡霉素能与OSCP结合，特异阻断这个H+通道，从而抑制ATP合成。有关ATP合成的分子机制目前还不十分清楚。4.解偶联剂的作用是促进H+被动扩散通过线粒体内膜，即增强线粒体内膜对H+的通透性，解偶联剂能消除线粒体内膜两侧的质子梯度，所以不能再合成ATP。总之，化学渗透学说认为在氧化与磷酸化之间起偶联作用的因素是H+的跨膜梯度。,73,活化的caspase-8将胞质中的Bid剪切，形成活性分子tBid（truncated Bid），tBid进入线粒体，导致细胞色素c释放，使凋亡信号放大。,
