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1、ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T XXXXXXXXX结核分枝杆菌-干扰素体外检测方法 In vitro detection for mycobacterium tuberculosis -interferon-无（本稿完成日期：2011-12-14）XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人：
2、杨坤宇、熊焕昌、李庶甘、陈帆、陈慧、张毅、陈彬、苏水宽、贺骥。本标准系首次发布的出入境检验检疫局行业标准。结核分枝杆菌-干扰素体外检测方法1 范围本标准适用于对国境口岸出入境人员感染结核分枝杆菌的体外检测，包括检测对象、标本采集和处理，检测程序，结果判定和报告。本标准适用于对国境口岸出入境人员感染结核分枝杆菌的实验室检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489 实验室生物安全通用要求WS288-2008 肺结核诊断标准3 术语和定义下列术语和定
3、义适用于本标准。3.1 结核病 tuberculosis由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis）复合群感染引起的慢性传染病，主要通过空气传播。结核病可累及全身各个器官，尤以肺结核最为多见。结核分枝杆菌复合群主要包括：结核分枝杆菌（M.tuberculosis）、牛分枝杆菌（M.bovis）、非洲分枝杆菌（M.africanum）和田鼠分枝杆菌（M.microti）.临床上最常见的是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。结核分枝杆菌多数为杆状，稍弯曲；菌体宽度0.3m0.60.3m；菌体长度在0.5m 8m之间，多数在1.5m 3.5m；少数菌体较长者可呈现螺旋状。染色良好的结
4、核分枝杆菌菌体内能发现着色较深的异染颗粒。3.2 -干扰素 interferon-脊椎动物受多种因素(如微生物)诱导产生的一种抗病毒蛋白质。-干扰素可影响细胞的运动和免疫过程，也可干扰多种病毒的复制。3.3结核分枝杆菌-干扰素体外释放试验 TB- interferon- release assay 结核分枝杆菌感染人体后会刺激外周血细胞特异性地分泌-干扰素，结核分枝杆菌-干扰素体外释放试验就是利用这一现象发展起来的一种评估结核分枝杆菌感染的体外检测方法。选用结核分枝杆菌特有的而卡介苗、其它分枝杆菌没有的特异性抗原ESAT-6和CFP-10体外刺激结核分枝杆菌感染者（包括临床结核患者和潜伏性结核
5、感染者）的外周血细胞，使其T淋巴细胞增殖、释放-干扰素等细胞因子，再通过检测特异性释放的-干扰素，判断是否存在结核分枝杆菌感染。这种方法对于涂阳肺结核、涂阴肺结核以及肺外结核的检测均具有很好的效果，且不受卡介苗和环境中常见其它分支杆菌的干扰。4 生物安全防护要求实验室结构和设施、安全操作规范、安全设备及个体防护应符合GB 19489 中二级生物安全防护实验室的要求。5 检测对象5.1 入出境旅客及国际航行交通工具员工。5.2 在华外籍人员及港、澳、台胞。5.3 国境口岸食品、饮用水及公共场所从业人员。5.4 其他申请检测的人员。6 材料与试剂6.1 仪器和器材6.1.1 37恒温箱。6.1.2
6、 小型台式离心机。6.1.3 自动洗板机。6.1.4 含波长450nm的酶标仪。6.1.5 II级生物安全柜。6.1.6 一次性采血针。6.1.7 真空抗凝采血管（肝素钠）。6.1.8 可调式微量加样器和熟料尖吸头。6.1.9 1.5mL EP管。6.2 试剂参见附录A1) 北京万泰生物药业股份有限公司的结核分枝杆菌-干扰素体外释放定量检测试剂盒（TB-IGRA）是适合的实例。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。)。7 样品的采集、处理与转运7.1 样品的采集和处理使用真空抗凝采血管抽取4ml静脉血，立刻颠倒混匀6次以上，使抗凝剂充分溶解。在采血管上标注被采集人员姓
7、名、采集时间和标本编号。7.2 样品的转运采集全血标本后，在2h内，在室温（1628）条件下由专人运送至实验室。8 实验室检测8.1 刺激培养采集全血标本后，尽快分装到测试培养管、本底对照培养管、阳性对照培养管等3种培养管中，每种培养管分装1mL全血标本，将培养管上下颠倒6次以上，保证全血与培养液充分混匀，再将培养管直立放于37恒温箱中静置培养22h。8.2 刺激培养产物收集与保存全血标本经刺激培养22h后，以4000r/min离心10min，吸取上清放于新的1.5mL的EP管中，做好标记。如果2天内完成ELISA定量检测，保存在28中，如果2天内不进行ELISA检测则保存在-20以下。8.3
8、 ELISA检测参见附录B。9 结果判定与报告9.1 标准曲线：用标准品的标定浓度为Y轴和对应的A值为X轴绘制双对数坐标散点图，进行乘幂拟合回归，并计算各种标本中-干扰素的含量。9.2 结果判定与报告9.2.1 阳性结果的判定同时符合以下三个条件者：本底对照管的读数400pg/mL；测试管的读数减去本底对照管的读数14pg/mL；测试管的读数减去本底对照管的读数25%本底对照管的读数。9.2.2 阴性结果的判定符合以下两个条件之一者：本底对照管的读数400pg/mL，测试管的读数减去本底对照管的读数14pg/mL，阳性对照管的读数减去本底对照管的读数20pg/mL；本底对照管的读数400pg/
9、mL，测试管的读数减去本底对照管的读数14pg/mL但25%本底对照管的读数，阳性对照管的读数减去本底对照管的读数20pg/mL。9.2.3 不确定结果的判定符合以下三个条件之一者： 本底对照管的读数400pg/mL，测试管的读数减去本底对照管的读数14pg/mL，阳性对照管的读数减去本底对照管的读数20 pg/mL；本底对照管的读数400pg/mL，测试管的读数减去本底对照管的读数14pg/mL但25%本底对照管的读数，阳性对照管的读数减去本底对照管的读数20pg/mL；本底对照管的读数400pg/mL。9.2.4 阳性结果的报告可反馈给受检者的报告为感染结核分枝杆菌的可能性极高。9.2.5
10、 阴性结果的报告可反馈给受检者的报告为感染结核分枝杆菌的可能性极低。9.2.6 不确定结果的报告与处理不能判断是否感染结核分枝杆菌，应重复检测或者用其它方法如影像学诊断、痰液涂片检测、分枝杆菌培养等进行检测，再根据检测结果发报告。10 阳性结果的处理对阳性结果应采用其它诊断方法，如影像学诊断、痰液涂片检测、结核分枝杆菌培养等进行确诊，其中肺结核的诊断参考标准WS288-2008。阳性结果应及时向上级主管部门报告。A附录A （资料性附录）主要试剂A.1 测试培养管重组结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6、CFP-10及RPMI 1640细胞培养液。A.2 本底对照培养管RPMI 1640细胞培养液
11、。A.3 阳性对照培养管植物凝集素A及RPMI 1640细胞培养液。A.4 校准品重组人-干扰素，每瓶200pg。A.5 酶标板重组人-干扰素单抗包被酶标板，每孔100ng；重组人干扰素-单抗标记HRP作为二抗。A.6 样品稀释液20%小牛血清。A.7 标准品稀释液20%小牛血清。A.8 浓缩洗涤液20PBST（20mmol/L NaCl, 2.68mmol/L KCL, 10mmol/L Na2HPO4, 1.76mmol/L KH2PO4, 0.05%Tween-20 ）。A.9 显色液辣根过氧化物酶底物显色液A和B。A.10 终止液2mol/L H2SO4。附录B （规范性附录）ELIS
12、A检测B.1 配液将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。B.2 标准品配制使用新鲜的去离子水0.5mL溶解标准品干粉，待标准品充分溶解2min3min后，轻轻混匀即得到400pg/mL的标准品，然后用200L的标准品稀释液倍比稀释，最终配制成浓度分别为400pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL的6种不同浓度的系列标准品。B.3 编号与加样品稀释液将样品对应微孔按序编号，每个受试者的3种培养血浆各加1孔，系列标准品加双孔，空白对照1孔（空白对照孔不加样品稀释液、样品及酶标试剂，其余各步相同）；分别在相应孔中加入样品稀释液 20L。B.4 加样分别在相应孔中加入待测样品或标准品各50L，轻轻振荡混匀。B.5 温育用封板膜封板后，置371温育601min。B.6 加酶每孔加入酶标试剂50L，空白孔除外，轻轻振荡混匀（加酶之前不洗板）。B.7 温育用封板膜封板后，置371温育601min。B.8 洗涤小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。B.9 显色每孔加入显色剂A、B液各50L，轻轻振荡混匀，371避光显色15min。B.10 测定每孔加终止液50L，轻轻振荡混匀，将酶标仪波长设为450nm（建议用双波长450nm/600nm650nm检测），用空白孔调零点后测定各孔吸光（A）值。_
