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1、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化的研究学 科 门 类：理学一级学科名称：生物学二级学科名称：微生物学研 究 方 向：应用微生物研 究 生：程本亮指 导 教 师：刘波 研究员完 成 时 间：二O一O年四月M.S. Thesis of Fujian Agriculure and Forestry UniversityThe study on differentiation of pathogenicity of Ralstonia solanacearum Discipline: ScienceFirst Rank Discipline: BiologySec
2、ond Rank Discipline: MicrobiologyResearch Field: Applied microbiologySupervisor: Prof. Dr. Liu BoSubmitted Time: April, 2010独创性声明本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位（毕业）论文作者亲笔
3、签名：日期：论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。不保密，本论文属于不保密。学位（毕业）论文作者亲笔签名：日期：指导教师亲笔签名：日期：目 录中文摘要IAbstractII第一章 绪论11 青枯病11.1 青枯病的发生与危害11.2 青枯病的防治12 青枯雷尔氏菌及其致病机理的研究进展22.1 青枯雷尔氏菌22.2 青枯雷尔氏菌的致病机理23 青枯雷尔氏菌种下分化的研究进展34 青枯雷尔氏菌致病
4、力分化的分子机理44.1 EPS I合成相关基因44.2 胞外蛋白及II型分泌系统和III型分泌系统的相关基因44.3 网络状调节系统相关基因55 研究目的及创新性6第二章 不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化71前言72 材料与方法72.1材料72.2方法72.3 统计83 结果与分析83.1 青枯雷尔氏菌的鉴定83.2 青枯雷尔氏菌致病力的测定93.3 番茄植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化113.4 花生植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化123.5 生姜植株中青枯雷尔氏菌分布及致病力分化124 讨论13第三章 生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化的研究151前言152 材料与方法152.1材
5、料152.2 方法162.3 统计163 结果与分析163.1 生防菌作用下青枯雷尔氏菌致病力分化163.2 生防菌持续作用下青枯雷尔氏菌Rs91的致病力分化183.3 青枯雷尔氏菌Rs91和Rs1100的继代培养过程的致病力分化194 讨论20第四章 青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理221前言222材料和方法222.1材料222.2 方法222.3 统计233 结果与分析233.1 青枯雷尔氏菌的转化233.2 青枯雷尔氏菌Tn5突变株Kmr基因的验证243.3 青枯雷尔氏菌Tn5突变株的遗传稳定性253.4 青枯雷尔氏菌突变株致病力测定263.5 青枯雷尔氏菌无致病力突变株插入位点284
6、讨论28第五章 青枯雷尔氏菌无致病力突变株与原始菌株的生物学异质性研究301前言302材料和方法302.1材料302.2 方法302.3 统计323 结果与分析323.1 初始pH值对无致病力突变株生长的影响323.2培养温度对无致病力突变株生长的影响333.3无致病力突变株生长曲线异质性333.4无致病力突变株胞外多糖含量异质性343.5无致病力突变株TTC液体培养基分光光度计吸收峰分析354 讨论36第六章 结论与展望38参考文献40附录45个人简历48致 谢49中文摘要通过对青枯病不同发病时期不同部位的番茄、花生和生姜植株的青枯雷尔氏菌进行分离，从番茄青枯病发病初期的病株根部和青枯病发病
7、后期的病株茎中部分离到的青枯菌中除了强致病力的菌株外，还分离到少量无致病力的菌株，从生姜病株的茎上分离到的青枯菌全都是无致病力的菌株。通过生防菌BC-0711和青枯雷尔氏菌1：1共培养试验，表明生防菌BC-0711对供试青枯雷尔氏菌均有抑制作用，但是对不同菌株的抑制率有所差异，生防菌对Rs466菌株的抑制率仅为4.6，对Rs91和Rs1447的抵制率较高，分别达到78.3和79.9，对其他菌株的抑制率介于43.559.6之间。对强致病力青枯雷尔氏菌Rs91和Rs1100连续5代的继代培养后发现Rs91未出现致病力分化，而Rs1100在第五代时出现致病力分化。生防菌BC-0711对Rs91连续处
8、理3代后，未出现致病力分化，对Rs1100第一次处理后即出现无致病力菌株的分化。通过Tn5转座子随机插入青枯雷尔氏菌(Rs91)获得1004株转座子随机插入突变株，其中有13株突变株具有无致病力青枯雷尔氏菌的形态特征，通过对其中5株突变株在TTC平板上的形态特征和番茄盆栽苗生物测定结果确定为无致病力菌株。经反向PCR测序和序列比对，分析鉴定出这5 株无致病力青枯雷尔氏菌突变株中有4株的插入位点分别位于phcA基因，有1株突变株的插入位点位于phcS基因上，并比较了这5株突变株与原始菌株的生理生化特性，这5株突变株的生长速率和相对胞外多糖含量显著低于Rs91，这5株突变株的TTC液体培养基在紫外
9、-可见分光光度计上于400-450nm波长上进行扫描，通过聚类分析，这5株突变株与Rs91分别聚为三类，插入位点位于phcA基因上的菌株聚为一类，插入位点phcS基因上的突变株为一类，原始菌株为另一类。关键字：青枯雷尔氏菌，致病力，分化，Tn5转座子，突变Abstract Ralstonia solanacearum were isolated from different parts of tomato, peanut and ginger in the different stages of bacterial wilt disease. The isolated strains incl
10、uded not only virulent strains but also avirulent strains in the root of tomoto in the early stage of bacterial wilt disease, the stem of tomoto in the late stage of bacterial wilt disease. The strains isolated from the stem of ginger both were the avirulent strain. The inhibitons of the biocontrol
11、bacterium strain BC-0711 (Bacillus cereus) against ten Ralstonia solanacearum virulent strains were investigated.But the inhibitions were diverse in different Ralstonia solanacearum virulent strains. The inhibitons of BC-0711 against Rs466 was only 4.6%,and significantly different from Rs91 and Rs14
12、47,which respectively was 78.3 and 79.9, and the others were between 43.5%-59.6%.After subculturing 5 generations , differentiation of pathogenicity didnt appeare in Rs91, but appeared in Rs1100 when it was subcultured to the fifth generation. BC-0711 and Rs91 were co-clutured for three generations,
13、 and its differentiation of pathogenicity still didnt appear. But Rs1100s differentiation of pathogenicity appeared after co-clutured with BC-0711 in the first generation. Mutants of Ralstonia solanacearum(strain Rs91) were constructed by using Tn5 transposon mutagenesis. And there were 1004 mutants
14、 being obtained. There are five avirulent mutants were identified by TTC medium and bioassay of potted tomato.And their insertion site flanking sequences were amplified by inverse PCR and sequenced. There were 4 avirulent mutants whose insertion sites were located in phcA gene. And there was 1 aviru
15、lent mutant whose insertion sites were located in phcS gene.The growth curve and the relative content of EPSI of this 5 mutants are significantly lower than strain Rs91.This 5 avirulent mutants and Rs91 were cultured in TTC liquid medium in the condition of 200rpm and 30 for 48h. And the supernatant
16、s of their culture were scanned by UV-spectrophotometer in the wavelength of 400-450nm.The result of scanning were analysed by UPGMA dendrogram.It indicated that this 5 avirulent mutants and Rs91 can be separated into 3 groups,the 4 avirulent mutants whose insertion sites were located in phcA gene i
17、n a group,the avirulent mutant whose insertion sites were located in phcS gene in a group and Rs91 in another group.Keyword: Ralstonia solanacearum; pathogenicity; differentiation; Tn5 transposon; mutantion.第一章 绪论1 关于作物青枯病1.1 青枯病的发生与危害细菌性青枯病（Bacteial Wilt）是由其病原菌青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种毁灭性
18、的土传病害，它广泛分部于热带、亚热带和温带地区，在我国南方各省发病严重。由于温室效应，气温升高，其分布范围向更高纬度的地区扩展1,2,3。青枯雷尔氏菌可以适应不同的环境，使得被侵染的寄主中有木本植物和草本植物，有一年生植物和多年生植物，有种子植物和被子植物，有双子叶植物和单子叶植物等，给青枯病的防治带来很大的困难4。它所危害的宿主植物超过50个科，包括番茄、茄子、辣椒、烟草、马铃署、花生等重要农业经济作物5及桉树、木麻黄、桑树等树木6，造成较严重的经济缺失。1.2 青枯病的防治 青枯病的防治在国内外均有广泛的报道，主要通过农业措施、化学药剂、先育高抗品种和生物制剂等进行防治，其中生物防治得到最
19、广泛的关注。由于我国耕地有限，轮作等7农业措施受到很大的限制。利用化学农药如：康地蕾得、青萎散、青枯灵、硫酸链霉素等对青枯病进行防治面临环境污染，而且存在青枯雷尔氏菌对化学农药产生抗药性，防效不高等诸多问题8,9。而选育作物抗病新品种，虽然已筛选获得部分抗原材料和高抗品种10-15，但是由于对抗病性能高的抗源材料的获得较难，且由于青枯雷尔氏菌的高度种下分化，使抗病品种无法大面积推广及抗病性能的退化的原因，制约了选育抗病新品种的发展。因此，研究采用无毒，环保的微生物（细菌、真菌和放射线菌）农药防治青枯病越来越受到关注。它们主要是从土壤中分离、从内生菌中筛选及构建基因工程菌等方法获得。朱育菁等（2
20、004）研制的BC-0711制剂对连作重病区的茄子青枯病具有良好的防治效果，同时对茄子植株具有显著促长作用16。徐玲等（2006）利用从番茄根际分离到的一株多粘类芽孢杆菌防治青枯病，获得很好的效果17。朱红惠等（2004）测定了AM真菌对青枯菌的抑制作用，结果表明，在接种青枯菌前4天接种AM真菌，可以明显降低青枯菌在番茄根面和木质部的数量18。潘文道等（2008）测定了放线菌St-145对番茄青枯病的防效，结果表明在先接种放线菌St-145后再接种青枯菌，其防治效果达到73.8319。对于利用无致病力青枯雷尔氏菌菌株防治青枯病国内外做了大量的研究，并有广泛报道，为防治青枯病提供了新的研究思路。
21、肖田等(2008)初步研究了青枯雷尔氏菌无致病力菌株对烟草青枯病的控病作用，取得较好的控病效果，两株无致病力青枯雷尔氏菌20天后的相对防效分别达到58.4%和97%20。无致病力青枯雷尔氏菌可通过物理诱变、自发突变和基因工程等手段获得。Frey et al. (1994)，杨宇红等(2008)利用基因工程法获得了无致病力的hrp-突变体21,22，Trigalet et al.(1990)、康耀卫等(1995)利用Tn5插入突变法获得青枯雷尔氏菌胞外蛋白分泌缺失的突变株23,24、罗宽等(1983)、陈庆河等(2003)利用Co60辐射和紫外光诱变25,26、王羽等（2004）利用分离自发突变
22、株27等方法获得了许多无致病力青枯突变株。关于无致病力青枯雷尔氏菌在防治青枯病方面的机理研究主要集中在无致病力诱导宿主植物产生抗性和无致病力青枯雷尔氏菌所产细菌素的抑菌作用两方面。何礼远等(1990)研究了通过无致病力青枯雷尔氏菌诱导花生植株产生抗病性，结果表明经花生茎部毛细管滴注接种,可诱导花生茎部产生抗病性,并可维持10天以上,且具有一定传导性，而花生种子接种无致病力青枯雷尔氏菌菌株后不能诱导花生地上部分的抗病性,但可以有效地防止土壤中青枯菌对花生根部的浸染,种植42天后的青枯病防治效果仍可达到66.628；董春等(1999)利用产细菌素的无致病力青枯雷尔氏菌株防治番茄青枯病，并认为细菌素
23、的抑菌作用和无致病力菌株诱导宿主产生抗性这两方面都对防治青枯病上起作用29。张赛群等（2008）研究表明在接种无致病力青枯雷尔氏菌以后，植物抗病反应中的关键物质（H2O2）和酶类（POD）均有显著上升，而分解H2O2的CAT活性处于被抑制状态，并推测接种后抗病蛋白产量也相应增加30。2 青枯雷尔氏菌及其致病机理的研究进展2.1 青枯雷尔氏菌青枯雷尔氏菌的菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性，具有极生鞭毛，有运动性，不形成荚膜和芽孢，菌体大小为0.50.7 1.52.5m。菌落在TTC培养基上有两种形态特征：一种为菌落流动性强，白边较宽，中心呈浅红色，这是强致病性的野生型菌株；另一种为菌落干燥，扁平，白
24、边很窄，中心呈暗红色，这是致病性弱或丧失致病性的变异型菌株3。2.2 青枯雷尔氏菌的致病机理目前世界上对青枯雷尔氏菌的致病机理已进行了广泛的研究，青枯雷尔氏菌经过植物根部的受损部位和根冠部位侵染植物，随后由维管组织扩散进入茎部31。青枯雷尔氏菌的致病性是多方面的且复杂的现象。青枯雷尔氏菌的产生多种致病因子包括胞外多糖（EPS I），多聚半乳糖醛酸酶32和内切葡聚糖酶33等植物细胞壁降解酶类及生长素、细胞分裂素和乙烯34等植物激素。对其致病机理的研究主要集中在它的胞外多糖，果胶酶和纤维素酶上。Hussain和Kelman（1958）首次报道了青枯雷尔氏菌发酵液离心后的上清液能够使番茄枝条萎蔫，而
25、缺乏EPSI的自发突变株没有这种现象发生35。因此认为植物体内的青枯雷尔氏菌分泌的胞外多糖，堵塞导管，阻碍植物的水分运输，从而表现出萎蔫的症状。另外，EPSI还可能掩盖了菌体表面的菌毛和脂多糖等结构，从而使寄主植物的免疫系统无法识别和攻击青枯雷尔氏菌36-39。遗传学研究也已证明EPS I是青枯雷尔氏菌关键的致病因子40。3 青枯雷尔氏菌种下分化的研究进展青枯雷尔氏菌是一个非常复杂的类群，呈现出高度的种下分化的多态性。Buddenhagen等41根据青枯雷尔氏菌对不同寄主致病性的表现进行划分为称为生理小种（race），至60年代，已命名了4个生理小种（见表1）。何礼远等42将不同于国外报道的部
26、分桑青枯雷尔氏菌菌株命名为5号生理小种。表1 青枯雷尔氏菌生理小种（卢同，1998）43Table 1. Race of Ralstonia solanacearum（Lu，1998）小种侵染作物烟草过敏反应L-酪氨酸培养基产生黑色素的情况小种1烟草及多种茄科植物产生坏死枯斑产生大量黑色素小种2只侵染香蕉与海里康产生过敏反应不产生黑色素小种3能侵染马铃薯和番茄产生黄化斑产生少量黑色素小种4能侵染马铃薯和茄子产生过敏反应对酪氨酸酶活性中等Hayward（1964）根据青枯雷尔氏菌对3种双糖（乳糖、麦芽糖和纤维二糖）和3种醇（甘露醇、甜醇和山梨醇）的氧化能力，将青枯雷尔氏菌分为4个生化型(biov
27、ariaty)即生化型I、II、III、IV44。我国的何礼远（1983）认为部分桑青枯菌不属于上述4种生化型，应属于新的生化型V45（见表2）。生理小种和生化型之间没有绝对的相关性，但是研究表明3号生理小种均属于生化型II。表2 青枯雷尔氏菌生化型鉴定（根据Hayward，1964和何礼远，1983）Table 2. Biovar of Ralstonia solanacearum（Hayward，1964He，1983）生化型乳糖麦芽糖纤维二糖甘露醇甜醇山梨醇生化型I-生化型II+-生化型III+生化型IV-+生化型V+-除了上述两种青枯雷尔氏菌的种下分化的分类方法以外，还有血清型、溶原型
28、、致病型和菌系等方法对青枯雷尔氏菌致病力分化进行研究43。其中青枯雷尔氏菌的致病型和菌系的分化是根据青枯雷尔氏菌对鉴别品种的反应性进行划分的。姚革等（1990）分析了四川省青枯雷尔氏菌的菌系及其分布后，发现在青枯雷尔氏菌生理小种I型中存在着互不侵染的现象46。帅正彬等（1997）对成都地区番茄青枯雷尔氏菌的生理小种进行分析后发现，同属一个生理小种的青枯雷尔氏菌接种番茄品种的结果表现出不同的致病力，研究结果表明在同一生理小种中的菌株，存在不同致病力分化47。另外，前人的研究表明，青枯雷尔氏菌存在着不同致病力的分化即强致病力菌株和无致病力菌株，前者侵入寄主植物，可导致寄主的发病；后者可以侵染寄主植
29、物，但不引起寄主发病48。有研究表明，在特定条件下，强致病力菌株，会散失致病性，弱化形成无致病力菌株；Kanda et al.研究表明（2003)营养条件和极端气候引起的病原菌基因突变等原因可使强致病力菌株产生弱化49；但在自然条件下，青枯雷尔氏菌的强致病力菌株具有保持致病性相对稳定的机制，抵抗外界条件，侵染寄主植物，引起植物病害50。4 青枯雷尔氏菌致病力分化的分子机理 青枯雷尔氏菌致病过程中的某些基因的突变，都会影响到青枯雷尔氏菌对寄主植物的侵染和致病力。其中包括调控和编码EPS I的基因，编码胞外蛋白的基因及II型分泌系统和III型分泌系统的相关基因，以及形成网络状结构的调节系统等。4.
30、1 EPS I合成相关基因EPS I是青枯雷尔氏菌的主要致病因子。EPS I生物合成途径的大部分蛋白质是由大小为16kb的eps操纵子调控和编码的。该操纵子由12个以上的基因构成，它的转录由一个启动子控制，且需要有10个调节基因的产物和3种以上的信号相互作用才能被完全的激活，eps操纵子上的任何一个基因的突变都会阻碍EPS I的产生51,52。Hussain报道了青枯雷尔氏菌缺乏EPS I的自发突变株的发酵液离心后的上清液不能使番茄枝条萎蔫35。4.2 胞外蛋白及II型分泌系统和III型分泌系统的相关基因青枯雷尔氏菌的胞外蛋白主要有10种，且都能较容易地从发酵液的上清液中检测出来53。其中包括
31、果胶溶解酶类和纤维素水解酶类等。果胶溶解酶类由果胶甲基脂酶和三种多聚半乳糖醛酸酶构成，三种多聚半乳糖醛酸由pehA、pehB、pehC基因分别编码，研究表明pehB的缺失突变株仅少量的降低青枯雷尔氏菌致病力，而pehA基因的突变株的可使青枯病发病时间比野生型菌株推迟1倍47,54。青枯雷尔氏菌能够产生2种胞外葡聚糖酶，Egl能够水解可溶性的纤维素，CbhA则能够降解结晶纤维素的末端55,56,Egl缺失突变的青枯雷尔氏菌使寄主植物发病的时间也有所延迟。与其他许多病原菌一样，青枯雷尔氏菌也存在2种分泌系统。由eep基因编码的II型分泌系统，能够分泌包括细胞壁裂解在内的大部分的重要胞外蛋白57,5
32、8。由hrp基因编码的III型分泌系统可直接向寄主植物细胞释放毒性蛋白因子,诱导宿主细胞产生各种生理效应，如超敏反应等59-62。研究表明，III型可能横跨了细胞膜的内膜和外膜，并将各种各样的致病因子及非致病性的蛋白运输到细胞外，抑制植物的免疫反应63。hrp基因簇包含了20多个基因,可能位于病原性基因岛内，其中任何一个基因的失活，似乎都会使青枯雷尔氏菌完全失去对寄主植物的致病力和在植物体内增殖的能力，以及在抗性品种植物体中引起过敏反应的能力64,65。4.3 网络状调节系统相关基因前人研究发现由于青枯雷尔氏菌适应植物体外的生存环境，它需要一个精细的调节网络来控制EPSI或其他致病因子（植物细
33、胞壁降解酶类）等的表达51。因此青枯雷尔氏菌对EPSI的分子调控是严格且复杂的过程。根据Huang等66对EPSI的分子调控机制的综述，整个调控网络至少包括了3个明显的信号传导机制,每个传导机制都具有独一无二的双组分系统即VsrAD、VsrBC和PhcSR。每个系统包含一个与膜结合的传感器激酶和一个特异感应调控因子。传感器激酶VsrA、VsrB或PhcS通过对其相应的特异感应调节因子VsrD、VsrC或PhcR磷酸化从而对某一环境信号作出响应，进而激活或抑制致病基因的表达。eps基因最大量的转录需要激活整个网络的所有组分。图1 青枯雷尔氏菌控制eps和其他基因表达的调控网络（Huang，199
34、8）Fig. 1.Organization of the regulatory network controlling eps and othervirulence genes of R. solanacearum.其中，青枯雷尔氏菌的表现型转换系统基因（phc）是调节青枯雷尔氏菌致病力的复杂网络结构的核心部分。Kelman等报道了发生致病力丧失的青枯雷尔氏菌自发突变株可能是由于phcA基因的突变后形成的67。phc系统包括LysR-型转录调控因子phcA68和控制phcA基因表达水平以适应青枯雷尔氏菌密度的phcBSRQ操纵子的产物组成69,70。phcA基因的表达水平的增强，使青枯雷尔氏菌
35、的毒性因子EPSI和胞外酶等产量大量增加，从而使菌株具有很强的致病力。当phcA基因的表达水平降低时，青枯雷尔氏菌仅合成少量的EPSI和较低活性的胞外酶，从而使菌株丧失大部分的致病力71,72。此外phcA基因还反向调控5F2基因的表达，位于hrp基因簇外围的5F2基因座的突变，会显著降低hrp-纤毛的产生、青枯雷尔氏菌的致病力等，而hrp-纤毛是hrp基因编码的III型分泌系统的一个成分，它对青枯雷尔氏菌的运动、粘附等起着重要的作用，它被推测可能是hrp基因编码的III型分泌系统向外输送蛋白质的通道73-76。 5 研究目的及创新性青枯雷尔氏菌菌落在TTC培养基上有两种形态特征的分化，即强致
36、病力菌株和无致病力菌株的分化。本实验室研究发现生防菌BC-0711处理野生强致病力青枯雷尔氏菌后，出现致弱现象。这种致弱现象与自发的致病力分化是怎样的关系呢？生防菌是否促进了青枯雷尔氏菌的分化？什么因素的改变影响了分化后的菌株致病力和菌落形态。本研究通过青枯雷尔氏菌继代培养和生防菌BC-0711处理青枯雷尔氏菌，观察青枯雷尔氏菌菌株的致病力分化。研究青枯雷尔氏菌自发的分化与生防菌引起的致弱现象之间的关系。通过进一步构建转座子Tn5插入突变体库，从中筛选出致病力和菌落形态发生分化的突变株，研究导致致病力和菌落形态分化的相关基因。并尽量多的保存因不同基因突变导致的无致病力突变株，用于研究利用无致病
37、力青枯雷尔氏菌防治青枯病。第二章 不同作物中的青枯雷尔氏菌致病力分化1前言作物感染青枯雷尔氏菌后，在青枯病发病初期，病株上部叶片出现萎蔫；进入发病中期后，在温度较高的午间，病株上部茎和叶片自上而下萎蔫，清晨和傍晚可恢复；到了发病后期，全株茎和叶片萎蔫枯死，枯死的病株在短期内仍保持绿色。病株茎部切开后，维管束吃呈褐色，进行溢菌检验时有溢菌现象。本研究采集青枯病不同发病时期（初期、中期、后期）的作物，对其不同部位中的青枯雷尔氏菌进行分离，了解不同致病力青枯雷尔氏菌在病株中的分布,及青枯雷尔氏菌在作物青枯病的不同发病时期的不同部位中的分布情况。2 材料与方法2.1材料样本：从福建建瓯采集结果期的番茄
38、（健康植株及青枯病初期和后期的植株，见附图2、3、4）、结果期的花生（健康植株及青枯病初期、中期、后期，见附图5）以及从福建福安采集的一株生姜病株（见附图6）。菌株：强致病力青枯雷尔氏菌Rs91 由福建省农业科学院农业生物资源研究所于番茄病株上分离保存。TTC培养基：10g蛋白胨，1g酪朊水解物，5g葡萄糖，17g琼脂，1000mL蒸馏水，pH值调节到约7.4左右，分装，121灭菌20min。灭菌后当冷却至55左右加入已灭菌的1%的TTC（2，3，5氯化三苯基四氮唑）水溶液其终浓度为0.005%，最终pH值为7.2左右。SPA培养基：5g蛋白胨，20g蔗糖，0.5g KH2PO4，0.25g
39、MgSO4，1000mL蒸馏水，pH值调节到约7.4左右，分装，121灭菌20min，最终pH值为7.2左右。1M NaOH：称取4g NaOH 溶于100mL去离子蒸馏水中，备用。2%SDS：称取2g SDS 溶于100 mL去离子蒸馏水中，备用。Taq酶、dNTP购于海英竣生物技术公司。引物pehA#3和pehA#677由上海英竣生物技术公司合成。引物序列为：pehA#3: 5-CAG CAG AAC CCG CGC CTG ATC CAG-3；pehA#6: 5-ATC GGA CTT GAT GCG CAG GCC GTT-3。仪器：THZ-D台式恒温振荡器、生化培养箱。2.2方法2.
40、2.1 青枯雷尔氏菌的分离称样：称取不同发病时期的番茄的根、茎基、茎中、叶柄、叶；不同发病时期的花生的根、茎基及生姜病株的根和块茎各5g。组织块研磨：用流水冲洗干净，剪成小块组织，在无菌操作条件下，经75酒精处理30s，再用10次氯酸钠消毒8min，取出用无菌水漂洗3遍，用榨汁机将组织块打碎，加入45ml无菌水溶解即配成10-1浓度的组织液。稀释：吸取1 mL10-1浓度的组织液至装有9 mL无菌水的试管，即配成10-2浓度，依次稀释配置成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7浓度的组织液。平板涂布：超净台上无菌操作，溶液在振荡器上振荡10-20s，吸取200 L至相应标记浓度的TT
41、C平板上，溶液滴至平板中央，用涂布棒涂匀。涂好的平板正放静置一会，使溶液渗透进平板中。每个梯度重复3次；培养：将涂好的平板用报纸包好倒置于30恒温箱中培养60h；划线分离纯化：观察分离培养的菌落，将要纯化的青枯菌菌落标上标记，无菌操作用接种环直接取平板上要分离纯化的菌落至相应标记的平板上，划线后放在30温箱中培养48h，待鉴定保存。2.2.2 青枯雷尔氏菌的鉴定挑取2环纯化的青枯菌于1.5ml灭菌离心管中，加入1L 1M NaOH和2.5L SDS（2%），再加入16.5l无菌水于95煮15min，然后加入180l无菌水，制备出菌株DNA，于-20保存。利用特异性引物pehA#3和pehA#6
42、进行鉴定，扩增得到的片断大小为504bp。25l的反应体系为：DNA模板10-20ng， Taq酶(5U/l) 0.3l，10PCR缓冲液2.5l，dNTP（10mM）0.5l，引物pehA#3和pehA#6（10M）各1l加无菌水至25l。反应程序：首先96 1min，然后按96 30s、70 30s、72 1min程序2个循环，再按94 30s、70 30s、72 1min程序33个循环，最后72下延伸5min。挑取已鉴定菌株，菌种库编号后，接种于SPA培养基中，200rpm，30培养48h，与灭菌的甘油（甘油终浓度为20-25）混合后于-80保存。2.2.3 青枯雷尔氏菌致病力的测定 根
43、据Hayward（1976）的方法辨别无致病力菌株，将保存于80编号为70、79、86、88和98的菌株活化后，接种于SPA培养基中，170rpm，30培养48h，菌液浓度达到108，稀释100倍后，灌根接种于番茄苗上，强致病力青枯雷尔氏菌Rs91做阳性对照，稀释后的未接种培养基做阴性对照。每盆灌根40 mL，每天观察发病率。（每株菌处理10株苗，番茄苗的生长状态为4叶期）。2.3 统计3 结果与分析3.1 青枯雷尔氏菌的鉴定挑取分离于番茄，花生和生姜上的菌株利用特异性引物对pehA#3和pehA#6进行鉴定，经PCR扩增鉴定，Rs91与待测菌株均扩增得到约为504bp大小的片且均为单一条带（
44、图6）。并保存了37株分离于不同植株上的青枯雷尔氏菌菌株。500bp500bp图7 37株青枯雷尔氏菌的鉴定（M：Marker；1-37：待鉴定青枯雷尔氏菌；：青枯雷尔氏菌Rs91；：CKFig. 7. Identification of the 37 strains of R. solanacearum(M:Marker;1-37: Unidentified R. solanacearum;+: R. solanacearum and :CK3.2 青枯雷尔氏菌致病力的测定通过对青枯病发病植株的青枯雷尔氏菌分离实验结果表明，从番茄，花生和生姜病株上均分离到了青枯雷尔氏菌，其中番茄和生姜病株中
45、分离到的青枯雷尔氏菌包括强致病力青枯雷尔氏菌和无致病力青枯雷尔氏菌,见图812。对无致病力青枯雷尔氏菌的致病力试验结果见附图1319。结果表明，Rs91在灌根接种后第4天部分番茄发病，接种后第6天番茄植株全部发病，发病率为100%；而无致病力菌株70、79、86、88和98接种7天后未发病，发病率为0。表明菌株70、79、86、88和98为无致病力突变株。图8 番茄病株上分离到的强致病力青枯菌Fig. 8.Virulence strain isolated from tomato图9 番茄病株分离到的无致病力青枯菌Fig. 9.Avirulence strain isolated from t
46、omato图10 花生病株分离到的强致病力青枯菌Fig. 10.Virulence strain isolated from peanut图11 生姜病株分离到的强致病力青枯菌Fig. 11.Virulence strain isolated from ginger图12 生姜病株分离到的无致病力青枯菌Fig. 12.Avirulence strain isolated from ginger 图13 Rs 91阳性对照Fig.13.Positive control图14 阴性对照Fig.14. Negative control图15 70号菌株致病性测定Fig.15. Determination of pathogenicity of strains 70图16 79号菌株致病性测定Fig.16. D
