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1、一种经济实用的大鼠侧脑室置管方法CHINESEJ()URNAL()FANAT()MYVol_32N0.32OO9解剖学杂志2O.9年第32卷第3期SchrattGM,TuebingF,NighEA,etal_AbrainspecificmicmRNAregulatesdendriticspinedeve1opmentJ.Nature,2OO6,439(7O74):283289.SchrattGM,NighEA,ChenWG,etaI.BDNFregu1atesthetranslati0n0faselectgmupofmRNAsbyamammaliantar譬etofrapamycinphosp
2、hatidyn0sito13一kinasedependentpathwayduringneuronaldevel0pmentJ.JNeurosci,20O4,24(33):73667377.AshrafSI,McI0onAL,Sc1arsicSM,etaI.Synapticproteinynthes|sass0ciatedwithmemoryisregu1atedbytheRISCpathwyinDr0sophi】a_J.cel1,2oo6,124(1):l9】2O5.LeungKM,vanHorckFP,IinAC,etal_AsyHm1etricalbetaactinmRNAtransla
3、tioningrowthconesmediatesattractiVeturnjngtonetrjnll_J.NatNeurosci,2OO6,9(1O):12471256.SilberJ,LimDA,PetritschC,etal_miR一124andmiR137inhibitproliferationofglioblastomamultiformecel1sandinducedifferentiationofbraintum0rstemcellslI.BMcMed.2OO8Jun24;6:14.ChanJA,KrichevskyAM,KosikKS.Micr0RNA21isanantiap
4、opt0ticfactorinhumang1ioblastomacellsJ.cancerRes,2OO5,65(14):6O296O33.DostJ,MourelatosZ,YangM,etaI.Numer0usmicroRNPsinneur.nalcellsc.ntainingn0velmicr0RNAsJ.RNA,2O03,9(2):18O186.NelsonPT,wangwX,RajeevBw.MicroRNAs(miRNAs)inneurDdegenerativediseasesJ.BrainPath0l,2OO8,18(1):13O138.DamianiD,AlexanderJJ,
5、()RourkeJR,etaLDicerinactiva=ti0nleadstopr.gressivefuncti0nalandstructuraldegene!_atj0nofthemouseretinaJ.JNeurosci,2OO8,28(19):48784887.PerkinsD(),JeffriesCD,JarskogLF,eta1.microRNAexpressjonintheprefr.ntalc0rtexofindividualswithschizophreniaandschizoaffectivedisorderJ.Gen0meBi0l,2OO7,8(2):R27.Grego
6、ryRI,YanKP,AmuthanG,etaLTheMicropr0cess0rc.mp】exmediatesthegenesisofmicr.RNAsJ.Nature,2OO4,432(7O14):23524O.PlanteI,DavidovicI,()uel1etDL,etaI.DiceDerivedMicr0RNAsAreUti1izedbytheFragileXMentalRetardati0nProteinf0rAssemblyOnTagetRNAsJ.JBi0medBjotechnol,2OO6,2OO6(4):64347.(编辑:黄会龙)一种经济实用的大鼠侧脑室置管方法董富兴徐
7、铁军(徐州医学院解剖学和神经生物学教研室,徐州2210O2)在中枢神经系统的动物实验中,理想的给药方法是先在动物的侧脑室埋植一套管,待动物从置管所引起的应激反应中恢复过来后,再从套管中给药,以避免应激反应对实验结果的影响.由于现在国内使用的套管几乎全部依赖进口,价格昂贵,大大限制了需要侧脑室置管实验的进行与推广.本着节约和创新的原则,笔者在实验中摸索出了一种套管制做简便,经济实用且能适应大多数国产大鼠脑立体定位仪的大鼠侧脑室置管方法.本方法的总体思路是先制做一个可以插入动物颅内且固定于颅骨上的套管,包括外管和封堵外管的内,然后需要一个能把外管固定于脑立体定位仪上以实施套管植入术的特殊连接装置,
8、最后制做一个专用微量注射器用来从外管中给药.实验结果表明,此种方法是可行有效的.1材料和方法1.1主要器械和材料脑立体定位仪(江湾I型c),微量注射器(5O1型,上海医用激光仪器厂),电吹风(广州市白云区欧凯电器厂),游标卡尺(无锡市衡星工量具厂),一次性静脉输液针(.5,山东威高集团医用高分子制品股份有限公司),诺和针(3OG,丹麦诺和诺德江苏省麻醉学重点实验室开放课题(KJSO7JO5);江苏省高校自然科学基础研究计划项目(O7KJB31O1】9)第1作者E-mail:dfx3O8tom.c0m通讯作者,E-mail:Xztjxu收稿日期:2)(9一O2一l1;修回日期:2OO9一O3一O
9、2412一公司,注射胰岛素常用针头),玻璃离子水门汀(上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂),水合氯醛,医用碘伏,红霉素软膏,一次性手术刀片,普通锯条,普通磨刀石,SD大鼠(25Og,雌雄不拘),以上材料除标注外,余者均为国产普通产品.1.2套管的制做方法1.2.1外管的制做将一次性静脉输液针用锯条按图1A所示从虚线部位锯成上,中,下3段,取中段,将其塑料端在磨刀石上打磨光滑,并将其金属底端打磨成锐角的斜面,打磨的过程中不断用游标卡尺测量,最终使得塑料端的长度为31m,金属针管端为5mm,做好后的外管如图1B所示.,图l外管的制做阳力力胡l二口口1.2.2内芯的制做取一个诺和针(图2A),用刀片
10、将中间的针芯从针帽上完全剥离,再从一端截取一段长为mm的针芯,在距断端3mm处将其折成9O.,并用直血管钳将断端用力夹闭一下以封闭末端,做好后的内芯如图2B所示.图2内芯的制做1.3连接装置的制做因大多数立体定位仪上没有夹持这种套管的装置,所以需要制做一个特殊的连接装置以连接立体定位仪与套管.此连接装置由两部分组成,一部分是可以固定在脑立体定位仪上的固定器,另一部分是用来承载外管的连接针,最后用玻璃离子水门汀将两者黏在一起.具体做法如下:取一个诺和针(图2A),用刀片将针帽剥下,即做成了连接针(图3A),然后,取一个一次性静脉输液针,将针尖磨平后套在图3A所示的A段上并用玻璃离子水门汀把接口封
11、牢,做好后的连接装置如图3B所示.图3连接装置的制做1.4专用微量注射器的制做因给药时需要将内针插入外管进行注射,但常用微量注射器的针头外径一般都比上述外管的内径粗.为此,需要将常用微量注射器简单改制一下,即将常用微量注射器的针头连接一段可以插进外管的诺和针针芯.具体做法如下:先制做一个图3A所示的连接针,然后用刀片切去1mm长的塑料(图中黑色部分),使其B段延长至9mm(图4A),最后将其A段插入微量注射器的针头里面,最后用玻璃离子水门汀将接口密封好,专用微量注射器就做好了(图4B)图4专用微量注射器的制做1.5套管植入术(1)调试立体定位仪,使得齿杆上缘低于耳杆中心3.3n1rn;(2)将
12、连接装置(图3B)的侧翼固定于立体定位仪的操作臂上,并将外管的上端套于连接针的下端,使得外管尖端垂直于颅骨平面;(3)大鼠经1O%水合氯醛麻醉后固定于脑立体定位仪上;(4)颅顶备皮,碘伏消毒后切开,钝性分离皮下组织,暴露骨膜后,用3OHzOz擦拭前囟点,使之清晰暴露;(5)用尖端磨平的12注射器针头在欲埋管处(Bregma点后O.8mm,矢状缝右侧1.5mm)钻一直径约O.6mm的小孑L,注意要将颅骨钻透而不伤及大脑,然后将外管缓慢插入此孔中(深度为颅骨下3.5mm);(6)用电吹风将颅骨表面干燥后,将配好的玻璃离子水门汀迅速(1min)以圆锥形均匀涂于外管周围;(7)待玻璃离子水门汀凝固后将
13、连接针缓慢旋出,几秒钟后即有脑脊液从外管流出,此时迅速将内芯插入外管以防止脑脊液外漏;(8)创面涂以适量红霉素软膏后缝合皮肤(将水门汀部分露出)后将大鼠放回笼中,单笼饲养.1.6给药方法术后第8天时,先将专用微量注射器吸好药液,然后排出空气,直至第一滴液体流出后,暂放备用.大鼠经乙醚轻度麻醉后,将其俯卧在手术台上,用镊子拔出内芯,同时迅速将微量注射器的针头全部插入外管,将药物缓慢匀速推进(4l/min),注射完毕后拔出针头,并迅速将内芯插入外管以封堵脑脊液.本实验中注射的药物为2Ol灭菌蓝墨水以检验套管是否植入侧脑室.2结果注射蓝墨水后随即处死大鼠,取脑沿针道冠状切开后可见针道穿透皮质及胼胝体
14、进入侧脑室,整个侧脑室都被染成蓝色.据前期实验结果统计,术后大鼠成活率在95以上,外管植入侧脑室的成功率在98以上.一413CHINESEJoURNAL0FANA)MYVo1.32No.32O09解剖学杂志20O9年第32卷第3期3讨论神经生物学实验中,常需要对中枢神经系统直接给药,这样不仅可避开血脑屏障而直接作用于脑组织,还可避免腹腔或静脉注射时肝对药物的首关消除作用而大幅减少药量,此外,Kokoeva等1报道侧脑室给药的效果是腹腔给药的3.5倍.目前常用的侧脑室给药方法有两种,一种是在脑立体定位仪的引导下用微量注射器将药物直接注射到侧脑室,此种方法虽操作简单,但是动物由插针而引起的应激反应
15、可能会干扰甚至是背离实验结果,而且也不适合长期连续性给药;另一种是在脑立体定位仪的引导下在侧脑室埋植一带有内芯的套管并固定在动物颅骨上,待动物从手术所引起的应激中恢复过来后,再从套管中注射药物到侧脑室,继之饲养5lOd,这也是目前国际上公认,并广泛使用的方法.此方法虽然相对复杂,但比较科学合理,且能节省药物开支,对实验结果的影响也较小.目前国内学者用这种方法时,所需套管及相应配件几乎完全依赖进口的一次性产品,不仅价格昂贵,而且还必须使用其配套的进口定位仪,操作步骤也较复杂.然而,迄今为止,国内介绍这方面技术的文章寥寥无几,虽有学者曾报道了可以重复使用进口套管的改良方法6,但其缺点是必须等前一批
16、动物处死之后才能进行下一批动物实验,这对于需要做大量动物实验的项目来说比较费时.本方法不但很好地弥补了以上方法的不足,而且其制作成本低廉,只有同类进口产品价格的5左有,操作方法也简单易掌握,效果稳定可靠.在现阶段,对于一般科研单位来说,本方法不失为一种经济实用,简单易行的方法.在使用本方法时需要注意几点:(1)外管的长度一定要严格控制,露出颅骨太长容易被大鼠抓掉,太短又不容易粘牢;(2)制做好的套管需浸泡在1O新洁尔灭溶液中24h以上;术前用无菌生理盐水冲洗3次,每次5min;然后再移入无菌生理盐水中浸泡1h;(3)术中保持创面清洁,缝合前涂以适量红霉素软膏,防止感染;(4)术后大鼠必须单笼饲
17、养,防止内芯或套管被其他大鼠抓掉.此外,对于使用非大鼠动物的实验者,只要能找到合适的材料做外管和内芯,也可以借鉴本方法的思路自己制做.参考文献1KokoevaMV,YinH,FlierJSEvidenceforconstitutiveneura1cel1proliferationintheaduItmurinehypothalamusJ.JCompNeur0l,2O07,5O5:2O922O.厂2K0vamaY,BabaA,MatsudaT.Intracerebroventricu1aradministrationofanendotheIinETBreceptOragonistincrease
18、sexpressiOnoftissueinhibit0r0fmatrixmetalloproteinase_1and一3inratbrain_J.Neuroscience,2OO7,147(3):62O一3O.3I艘CL,Ku0TF,wangJJ,etal_Redm0ldriceameliorates.mpairmentofmem.ryandIearningabiIityinintracerebr0ventricuiaramyloidbetainfusedratbyrepressingamyloidbetaaccumuIationlJ.JNeur0sciRes,2OO7,85(14):3l71
19、3l82.4schmidtAP,B6hmerAE,LekeR,eta1.Antinociceptiveeffectsofintracerebr.ventricularadministrationofguaninebasedpurinesinmice:evidencesf.rthemechanism0facti0nJ.BrainRes,2OO8,l234:5O一58.5JeeYs,K.IG,sungYH,etaLEffects.ftreadm.1lexerciseonmemoryandcFosexpressioninthehippocampusoftheratswithintracerebr0v
20、entricularinjectionofstreptozotocinJ.NeurosciLett,2O08,443(3):18892.6于海明,王百忍,李改丽,等.大鼠侧脑室置管方法的改良J.神经解剖学杂志,2)(5,21(2):2O72.(编辑:黄会龙)抗原修复对肿瘤耐药基因表达的影响马健波杨微荣贾国凤朱正鹏(郧阳医学院附属东风医院病理科,十堰442)O8)免疫组织化学技术随着3O多年的应用与发展,已成为科研和临床实际应用中不可缺少的检测手段,特别是在判断肿瘤组织的起源,分类以及肿瘤耐药性研究方面发挥了重要的作用.在免疫组织化学显色的各个环节都有可能影响抗原抗体复合物真实表达的因素,尤其是
21、组织中抗原的修复.每个实验室都有各自特殊的实验环境,为探索适合自身条件的实验方法,现就肿瘤耐药基因在不同抗原修复条件下的表达进行检测,分析和探讨.1材料和方法1.1材料选取本院2O052OO7年肺癌(鳞癌和腺癌)3O例组织标本,所有标本均经10福尔马林溶液固定,石蜡包埋,4m厚度连作者E_mail:majb收稿日期:2OO8一O811;修回日期:2OO8l217414一续切片.1.2相关试剂sP超敏试剂盒;pH6.O的柠檬酸缓冲液;pH9.O的乙二氨四乙酸二钠(EDTA);胰酶消化液(原液与稀释液1:3配制);显色剂二氨基联苯胺(DAB);gp,一抗,克隆号C494,即用型;Gst一,一抗,克隆号LvO29,即用型;5一Fu,一抗,克隆号TslO6,即用型;以上试剂均购自福建迈新生物技术开发有限公司.1.3抗原修复方法每种抗体分4组进行实验:第1组胰酶37消化15min;第2组pH6.O柠檬酸缓冲液(O.OlmmoI/I)高压锅热修复(方法:将抗原修复液加热至沸腾,再把组织切片至修复液中,盖盖,上压力阀,喷气3min);第3组pH9.OEDTA水浴热修复(方法:抗原修复液加热至微沸,放入切片,加盖继续加热2On1in);第4组pH6.o柠檬酸缓冲液(0.o1mm0l/I)高压热修复加胰酶37消化15min(方法:先热修复,静置室温后再进行胰酶消化).
