《CTGF对腹膜间皮细胞上皮间质表型转化的调控及对胃癌腹膜转移影响.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CTGF对腹膜间皮细胞上皮间质表型转化的调控及对胃癌腹膜转移影响.doc（12页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：圭基盔因 日期： 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离
2、校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 目 录一、摘要 中文论著摘要 英文论著摘要二、英文缩略语 三、论文论文一 前言 刚吾“ 材料与方法 实验结果 讨论” 结论“论文二 前言 日舀” 材料与方法 实验结果 讨论 结论一论文三 前。言“ 刚舌“ 材料与方法 实验结果 讨论 结论四、本研究创新性的自我评价五、参考文献
3、六、附录 一 一 期 问 秉 硼 成 绩 一 一 综在致个 述学谢人 简 介 一 疆誓曩辱 中文论著摘要对腹膜间皮细胞上皮间质表型转化的调控及对 胃癌腹膜转移影响的研究 刖 罱 胃癌是消化道系统最常见的恶性肿痛。虽然近年来在其诊治方面取得了一些成绩，但预后仍不理想，我国胃癌的死亡率仍居恶性肿瘤前列。腹膜转移是进展期胃癌根治术后最常见的复发形式，也是胃癌患者最主要的死亡原因。目前，国内外许多学者认为腹膜转移是特殊的肿瘤细胞与腹膜适宜的环境相互作用的结果，涉及粘附、降解、移动、血管生成、免疫逃避等诸多方面。 正常腹膜为三层结构：表面为单层间皮细胞层；其下为一薄的连续的胶原纤维层，内含少量基质细胞，
4、最下一层为脂肪组织层。扁平状的间皮细胞呈连续排列，覆盖于盆腹腔各壁的内面及腔内各器官的表面，呈半透明状，薄而光滑，能分泌、表达多种细胞因子、粘附分子及基质成分，是一道天然的机械防御屏障，避免问皮下组织的暴露以及微生物的侵袭。进展期胃癌常发生腹膜转移，而腹膜转移是一个多阶段的过程，在这个过程中，覆盖在腹膜表面的间皮细胞无疑发挥着重要的作用。 结缔组织生长因子（ ）于上世纪年代初在血小板衍化生长因子（ ，）的诱导下从人脐周静脉内皮细胞文库中首次发现。编码人类的基因定位于染色体，包含个外显子，个内含子，含个氨基酸。近年来研究发现，与细胞外基质相互作用，调节多种组织恶性肿瘤的发生发展、血管生成及浸润转
5、移。 上皮问质转化（ ，）是指完全分化的上皮细胞表型改变以后转变成完全分化的问质细胞，通常转变为成纤维细胞或肌成纤维细胞的过程。在正常胍胎发育及组织创伤修复中发挥重要作用，病理状态下主要参与器官纤维化与肿瘤浸润转移。受多种细胞因子调节，其中被认为是导致的主要分子。是的下游效应分子，介导了的效应。有研究发现能直接诱导体外培养的肾小管上皮细胞发生。本研究拟研究在腹膜问皮细胞过程中的作用，并探讨其对胃癌腹膜转移影响。 材料与方法一、 细胞培养和处理 间皮细胞系在”、湿度温箱中培养，培养液为力 体积分数的胎牛血清，含青霉素和，贴壁生长，天以：传代，通过胰蛋白酶消化后收集。不同时间用不同浓度重组人（）及
6、肿瘤细胞上清处理问皮细胞，光镜下观察、日皮细胞处理后形态变化。二、 激光共聚焦显微镜 无菌盖玻片经多聚赖氨酸包被后，置于六孔培养板。细胞均匀接种于六孔培养板内（ ），生长融合至时，按实验需要分组，并加入处理因素处理，每组设个复孔，取盖玻片行免疫荧光染色方法测定细胞钙粘蛋白（），波形蛋白（）及仅平滑肌肌动蛋白（【）的表达情况。三、 蛋白印记法 每组收集细胞，加入细胞裂解液，”超声波粉碎，过夜后吸出上清液，” ，离一。调整各标本蛋白浓度一致。每孔加样，聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶电压，浓缩胶电压。在水浴式转印槽中转膜，将膜封闭，加入一抗，”孵育过夜。然后将膜置于辣根过氧化物酶标记的二抗中，室温孵育，
7、洗膜 次，发光法检测。四、 实时定量逆转录聚合酶链反应（ ， ） 用试剂提取细胞，总，测定浓度、纯度，根据试剂盒步骤进行 。采用法比较值（ ），以为内参，相对定量样本靶基因表达水平。每一试验至少重复三次。五、 细胞粘附实验 将问皮细胞以每孔个细胞铺于孑，板中，不同时间用不同浓度重组人（）及肿瘤细胞上清处理间皮细胞。再加入标记的细胞，温箱中培养。 培养结束后，吸出培养液，缓慢冲洗三次，在荧光酶标读数仪进行荧光值的测定。细胞粘附率粘附细胞荧光强度空白组荧光强度细胞总数荧光强度空白组荧光强度。并在荧光显微镜下观察粘附情况。六、 裸鼠体内成瘤实验 取雌性裸鼠只，分为三组，每组只。其中一组腹腔注入无血清
8、，另外一组腹腔注）浓度的，两周后，取处于对数生长期的胃癌细胞株消化、重悬，调整细胞浓度为 ，每只裸鼠腹腔内注射胃癌细胞。以上裸鼠周后拉颈处死，观察腹腔内成瘤及腹水情况。 结 拿口卜 果 体外实验显示不同浓度可使腹膜间皮细胞发生形态改变，由原来的椭圆形铺路石样变为长梭形，且排列极性消失。 结果显示处理过的腹膜间皮细胞 表达下降，肌纤维细胞标志物【、 表达上升。及免疫荧光法测定的蛋白表达下降，伐、蛋白表达上升。以上情况表明可诱导腹膜间皮细胞发生。我们又检测了种胃癌高转移细胞系，及间皮细胞上清中的含量，发现种高转移细胞系的浓度较高，而间皮细胞上清中的含量很低。我们用上清液与问皮细胞共培养，发现 及蛋
9、白表达同样下降；【、 及蛋白表达同样上升；而且间皮细胞形态也变为长梭形。这说明含有较高浓度的胃癌细胞系上清液也可使腹膜间皮细胞发生。我们应用转染 胃癌细胞，瞬时转染后收集上清培养问皮细胞，其程度明显降低。同时在上清中加入中和抗体，其现象被部分逆转。通过体外粘附实验，我们发现经过及胃癌细胞上清处理的腹膜间皮细胞与胃癌细胞的粘附率明显高于正常间皮细胞。裸鼠体内实验我们发现，腹腔注射重组段时间的裸鼠较注射及未注射组的裸鼠体内瘤节结生长及腹水生成明显增多。这说明可以诱导腹膜间皮细胞发生，而且对胃癌细胞的腹膜转移有促进作用。 结 论 体外可以诱导腹膜问皮细胞系发生，而且的程度与 的浓度及作用时间有关。
10、含有较高浓度的胃癌细胞系上清液也可使腹膜间皮细胞发生，应 用中和抗体可部分逆转现象。 经过及胃癌细胞上清处理的发生的腹膜问皮细胞与胃癌细胞的粘 附率明显高于正常间皮细胞。 腹腔注射一段时间的裸鼠较注射及未注射组的裸鼠体内瘤节结 生长及腹水生成明显增多。 关键词胃癌；腹膜问皮细胞；腹腔微环境 英文论著摘要 欤椋幔? ， ， ， ， ， ， ， （）， （） （） ： ， ， ， ， （ ） （ ） ， （ ） ， ， ， （）， ， ” ，【一、 ； ， ， ， ， ， ， ， ， （ ） ， （）， ”， 一 ， ； （ ，） ： ， ， ， 、 ， 【、 ， 簦瑁幔? ， ； 伐一、 ， ，
11、 ， ， ， ， ， ； ； 英文缩略语 论文一 在腹膜间皮细胞上皮间质表型转化中 作用的研究 刖 吾 胃癌是消化道系统最常见的恶性肿瘤。虽然近年来在其诊治方面取得了一些成绩，但预后仍不理想，我国胃痛的死亡率仍居恶性肿瘤前列。腹膜转移是进行期胃癌根治术后最常见的复发形式，也是胃癌患者最主要的死亡原因【】。目前，国内外许多学者认为腹膜转移是特殊的肿瘤细胞与腹膜适宜的环境相互作用的结果，涉及粘附、降解、移动、血管生成、免疫逃避等诸多方面。 正常腹膜为三层结构：表面为单层间皮细胞层；其下为一薄的连续的胶原纤维层，内含少量基质细胞，最下一层为脂肪组织层。扁平状的间皮细胞呈连续排列，覆盖于盆腹腔各壁的内
12、面及腔内各器官的表面，呈半透明状，薄而光滑，能分泌、表达多种细胞因子、粘附分子及基质成分，是一道天然的机械防御屏障。避免间皮下组织的暴露以及微生物的侵袭。进展期胃癌常发生腹膜转移，而腹膜转移是一个多阶段的过程，在这个过程中，覆盖在腹膜表面的间皮细胞无疑发挥着重要的作用。 结缔组织生长因子（ ，）于上世纪年代初在血小板源性生长因子（ ，）的诱导下从人脐周静脉内皮细胞文库中首次发现【】。的结构包含个外显子，个内含子，起始位点是，其端包括个位点。第一个外显子编码信号肽，另外四个分别编码个不同的功能结构域，：（）胰岛素生长因子（ ，）结合蛋白区，包括个半胱氨酸残基，与类胰岛素生长因子结合蛋白（）有相一
13、致的序列（），是一个公认的胰岛素结合模式；（）因子型重复（分子），这个区域与单聚作用和蛋白复合物的形成有关，包括个半胱氨酸残基；（）血小板反应蛋白型重复（，），包括了个半胱氨酸硫酸化糖蛋白；（）生长因子半胱氨酸群，包括了剩余的个半胱氨酸。 上皮问质转化（ ，）是指完全分化的上皮细胞表型改变以后转变成完全分化的间质细胞，通常转变为成纤维细胞或肌成纤维细胞的过程【。在正常胚胎发育及组织创伤修复中发挥重要作用，病理状态下主要参与器官纤维化与肿瘤浸润转移。受多种细胞因子调节，其被认为是导致的主要分子（司。是的下游效应分子，介导勺效应【。有研究发现能直接诱导体外培养的肾小管上皮细胞发生，应用抗体或反义寡
14、核苷酸能阻断这一过程。本研究主要探讨在腹膜间皮细胞过程中的作用，以期为研究在胃癌腹膜转移腹腔微环境变化过程中的作用打下基础。 实验材料一、材料 （一）、细胞系 人胃癌细胞株、及人腹膜间皮细胞系由中国医科大学细胞生物教研室提供。 （）、主要仪器、超净工作台（北京）、培养箱（ 公司，日本）、倒置显微镜（公司， 日本）、光学显微镜（公司，日本）、荧光显微镜（公司，日本）、 低温超速离心机（型，美国和，日本）、超低温冰箱”（公司，同本）、制冰机（公司，美国）、 仪（ ，美国） 、电泳仪（型，北京）、 电泳槽：型（北京）、水浴式转印槽（北京）、垂直电泳槽：（ ，美国）、紫外分光度计（，英国）、自动电泳凝胶成像分析系统（ ， ，）、 自动酶标检测仪（美国）、 电子天平（公司，美国） 、 微量移液器（公司，法国；公司，德国）、 自动高温高压锅（公司，同本）、膜（公司，美国）、荧光酶标仪（ ，奥地利）、超纯水装置（ ，美国）、多通道共焦激光扫描显微镜（，德国）、 试验器材：孔、孔、孔板，以及塑料培养瓶为美国公司产品。 （三）、主要试剂弓物（公司，日本） 试剂盒（公司，同本） （公司，日本）二甲基亚砜（公司，美国）酶（公司，美国）（公司，美国）抽提试剂盒（公司，美国）焦碳酸二乙.
