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1、HPV E7基因在细胞周期中的作用研究进展靳华，王飞 东南大学附属中大医院皮肤性病科摘 要 人类乳头瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）E7基因参与免疫逃逸、DNA损伤、抑制凋亡、干扰细胞周期等。E7可与pRb家族、E2F家族、细胞周期相关蛋白、链蛋白等多种细胞周期调控因子相互作用，导致细胞周期改变甚至恶变。关键词 HPV，E7，细胞增殖，pRb，E2F，细胞周期相关蛋白；Advances in the research of the role of HPV E7 gene in cell cycleJIN Hua，WANG Fei(Department of Derm
2、atology and Venereology， the Affiliated Hospital， Southeast University， Nanjing 210009，China)Abstract E7 gene is known as one of the oncogenes of Human papilloma virus (HPV).E7 oncoprotein can promote diseases by participating immune escaping， chromosomal instability， DNA injury and inhibition of ap
3、optosis or senescence. The pRb family， E2F family， cell cycle-associated proteins and beta-catenin are its targets which are associated with cell cycle. These activities contribute to its role in cell proliferation even cancer.Key words HPV，E7，cell proliferation，pRb，E2F，cell cycle-associated protein
4、s;人类乳头瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）感染可能导致尖锐湿疣、扁平疣、鲍温样丘疹病等疾病，甚至可能导致宫颈癌、阴茎癌等。HPV的这些作用与HPV E7基因及其产物密切相关,。本文综述HPV E7在细胞周期中的作用。1 HPV E7概述HPV E7基因与E1、E2、E4、E5、E6 5个基因同时位于HPV基因组的早期区，编码长大约100个氨基酸的E7蛋白。根据氨基酸序列的同源性，E7蛋白可分为3个保守区CR1、CR2和CR3。CR2 区包括一个严格保守的Leu-X-Cys-X-Glu （LXCXE） 序列，这个序列对视网膜母细胞瘤蛋白（protein retino
5、blastoma，pRb）有着高度的亲和力。靠近LXCXE序列的是酪蛋白激酶（casein kinase，CK）II 的磷酸化位点，其磷酸化与E7蛋白的转化活性密切相关。CR3区包含两个被29或30个氨基酸残基分离的CXXC序列， 组成了锌指结构域（zinc binding domain）1。HPV E7在细胞周期中的作用是病毒生存所必需的。皮肤的基底细胞进行一种不对称有丝分裂，其中一个子代细胞依然保持未分化的增殖状态，继续构成基底细胞层，另一个子代细胞则变为基底上细胞退出分裂周期而开始分化，并逐渐往基底层上方移行2。HPV首先以低拷贝数感染基底细胞的一部分，感染后的某一时间点，环状DNA开始
6、复制。接着，被感染的基底细胞进入到上皮的增殖区域，病毒周期进入质粒期或游离基因持续期，此期病毒的基因表达最少，特别是癌基因E6和E7的表达控制在一个非常弱的水平。其后，伴随着早期基因E6和E7的大量表达，所有病毒基因的表达均开始明显升高。病毒开始大量复制DNA，最终L1和L2衣壳蛋白表达，并组装成有感染性的病毒。HPV只编码一种DNA复制酶E1/E2，除E1/E2蛋白之外，其复制完全依赖于细胞的复制结构，但HPV复制过程却发生在分化的并已经退出细胞分裂周期的基底上细胞中，这些细胞缺少病毒复制所必需的蛋白等，这就需要宿主细胞退出分化，重新进入细胞周期，HPV E7则在此起关键作用3。正常情况下，
7、E6和E7基因的表达受HPV E2基因的调控而处于一种较低的水平，此时被感染的细胞不发生无限增殖或恶化。但当E2基因发生缺失等突变或E2蛋白失活时，E6和E7的表达失控，过表达的E6和E7蛋白则可以与多种细胞周期调控因子作用，进而可能导致细胞退出分化，进入细胞周期，细胞无限增殖甚至恶化。2 E7蛋白在细胞周期中的作用细胞周期分为四期：Gl、S、G2、M期，前三期合称间期，M期即分裂期。如果失去增殖原刺激，细胞停止于Gl期不再向S期过渡而停止增殖，此时的细胞称为G0期细胞。细胞周期受多种调控因子的调节（如视网膜母细胞瘤蛋白（protein retinoblastoma，pRb）家族、袋状蛋白（p
8、ocket proteins，E2F）家族、细胞周期相关蛋白等），它们在细胞周期的不同时段发挥各自的作用，共同调节细胞周期的演变。E7则可以与这些细胞周期调控因子相互作用，从而引起细胞周期的失控，导致上皮细胞的过度增殖甚至恶变2.1 E7与pRb家族Rb基因是第一个被克隆的肿瘤抑制基因，在细胞周期等进程中发挥重要作用。Rb基因产物为pRb家族，包含pRb、p107、p130和p600等。目前关于E7与pRb家族作用的研究较多，已发现E7可以与pRb、p107 、 p1304和p6005等多个pRb家族成员相互作用。pRb是细胞周期调控途径之一P16INK4 CyclinD1CDK4/6pRbE
9、2F途径的关键点。pRb的去磷酸化的形式是其活化形式，它与E2F转录因子连接阻止细胞进入S期。在正常的细胞周期中，去磷酸化的pRb被cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2复合物磷酸化，导致pRb与E2F分离，E2F被释放而发挥其转录因子效应，进而允许正常的S期进展6-7。同时，细胞中还存在着一种对此途径进行抑制的负反馈调节，这种负反馈调节是通过P16来完成的。P16能与CyclinD1竞争性结合CDK4/6或特异性结合CDK4/6，抑制CDK4/6的激酶活性，使pRb不能磷酸化，进而诱导细胞G1S期停滞。这种负反馈使细胞增殖保持在正常水平，没有肿瘤的产生。E7蛋白则可以直接与
10、去磷酸化的pRb连接，阻止它与E2F的作用，并使P16的负反馈作用消失，因此，过表达E7蛋白的细胞失去了G1/S转换点的检查点控制，细胞持续通过细胞周期，导致细胞增殖的失控7-8。低危型HPV和高危型HPV E7蛋白与pRb家族作用的能力有所不同，有报道称HPV 58中，E7蛋白使pRb的下降水平比HPV 16中pRb的下降水平低9，HPV 16 E7的细胞中，p130含量也比HPV 6 E7细胞多10-11。 2.2 E7与E2F家族E2F家族包括经典E2F（E2F1-E2F5）和非经典E2FE2F6，前者是转录因子，调节在细胞周期进程、核苷酸合成、DNA复制、DNA修复和细胞凋亡中起关键作
11、用的基因，后者的作用则是抑制转录。E2F6的表达在S期激活，且依赖经典E2F，抑制与经典E2F反应的启动子的活性，从而以一种负反馈方式减慢细胞的S期进程和/或直接使细胞退出细胞周期而进入分化。Hwang 等人12发现HPV16 E7蛋白可以直接连接E2F1，增强E2F1介导的转录，从而使细胞不断增殖。 Margaret E. McLaughlin-Drubin13的研究显示，低危和高危HPV E7蛋白均能使E2F6的转录抑制功能失活，从而扰乱关键的细胞保护机制，导致HPV感染细胞的S期感应性增加，加速细胞的S期进程。由以上研究可推测E7蛋白通过E2F家族而影响细胞周期的机制是：E7蛋白使经典E
12、2F转录活性增高，细胞为了抵抗这种转录的增强而大量表达起负反馈作用的E2F6，此时虽然E2F6大量表达，但其活性却被E7抑制，故细胞最终还是往增殖方向发展。McLaughlin-Drubin的研究还认为，E2F6是Polycomb group (PcG) 蛋白（PcG蛋白是一组通过染色质修饰调控靶基因的转录抑制子）复合物的组分之一，E2F6和PcG蛋白连接，共同抑制转录，而表达E7的细胞E2F6/PcG 复合物染色减少，这可能与E7蛋白对E2F6的抑制作用有关。2.3 E7与细胞周期相关蛋白细胞周期相关蛋白包括三大类：细胞周期蛋白（cyclins）（cyclin A、cyclinE等）、细胞周
13、期蛋白依赖激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）（CDK2、CDK4等）、细胞周期蛋白依赖激酶抑制蛋白（cyclin-dependent kinases inhibitory protein，CKI）（P16、P21、P27等）。正常细胞中，CDKs与cyclins结合促进细胞周期进展，CDKs与CKIs结合，抑制细胞周期进程。HPV感染时，E7蛋白可以与多种细胞周期蛋白相互作用，以多种方式扰乱正常细胞周期，促进细胞增殖。Cyclin E/CDK2复合物主要作用于G1/S转换期，促进细胞从G1期进入S期，cyclinA/CDK2复合物则主要作用于S期，促进细胞的S期
14、进程。过去曾认为E7通过与pRb家族成员相互作用来间接调节Cyclin E/CDK2 和cyclinA/CDK2的活性，促进细胞增殖。Christine L. Nguyen等14研究则报道，HPV 16 E7蛋白可以在不依赖pRb、 p107或p130的情况下，与cyclin A/CDK2或cyclin E/CDK2复合物连接，从而增强它们的活性，促进细胞从G1期进入S期或加快S期进程；HPV 6和HPV 11 E7蛋白也可以在pRb/p107/p130缺失的细胞中与CDK2复合物相互作用。此外，纯化的HPV 16 E7蛋白可以在体外与cyclin/CDK2 相互作用。这些均表明HPV E7
15、可以在缺少其他细胞连接蛋白的情况下直接与cyclin/CDK2复合物相互作用，增强它们促进细胞周期进程的作用。该研究还发现，在pRb、p107、p130全部被敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（TKO MEFs）中， HPV 16 E7蛋白与CDK2的作用不依赖于传统的HPV 16 E7蛋白与pRb的连接位点，但具体连接序列还需进一步研究。P27是CKI成员之一，它一方面能抑制在正常细胞中已结合到cyclin并已激活的CDK，如纯化的P27能抑制cyclin E/CDK2 和cyclinA/CDK2等，另一方面也能抑制CDK的激活过程，从而阻滞细胞的G1、S期进展。Yan X等人15研究显示，E7表达后
16、，P27水平升高，但大多数P27蛋白位于胞浆中，且没有阻滞细胞周期和接触抑制的作用，表明E7通过使P27进入到胞浆中而废除了它的细胞周期阻滞作用。该研究还发现，当P27高表达并位于胞浆时，细胞迁移速率升高，说明E7-P27的相互作用还赋予了被感染细胞癌细胞的特征，即侵袭性质。2.4 E7与其他细胞周期调控因子核磷蛋白（Nucleophosmin，NPM）又名B23、NO38、Numatrin，是一种多功能的核仁磷酸化蛋白，参与核糖体的生物合成，控制中心体复制，具有分子伴侣功能，并可通过多种信号通路调节细胞增殖和凋亡。McCloskey R等16报道，在表达E7蛋白的人类包皮角质形成细胞（HFK
17、s） 中，经甲基纤维素诱导而分化后，NPM的水平升高，升高的NPM的表达是转录后的，敲除NPM，HFKs的增殖能力下降，分化标志物的水平升高。由此推测，E7蛋白与NPM作用，促进增殖和抑制分化。链蛋白也与细胞增殖密切相关，稳定的链蛋白可以移至胞核，并与其中的Tcf转录因子结合，从而刺激转录，使细胞周期进程加快，细胞不断增殖。Rampias T等人17用HPV 16阳性的口咽癌细胞系147T 和090 、HPV 阴性的040T和宫颈细胞系SiHa （负荷有整合的HPV 18），来衡量E6/E7基因沉默前后胞浆和胞核中链蛋白的水平以及链蛋白/Tcf转录子的活性，结果显示，HPV E6和E7基因阻遏
18、后，胞核中 链蛋白水平的显著降低，且萤光素酶分析显示，与链蛋白有关的Tcf启动子的转录活性在基因沉默后降低，细胞周期进程减慢，细胞增殖速度变缓或进入分化。由此可见，E7蛋白可以升高链蛋白的表达水平，进而通过增强链蛋白/Tcf转录子的活性而促进转录，导致细胞增殖及存活而不进入分化。3 小结HPV E7基因及其产物在细胞周期中的作用与细胞增殖密切相关。E7可以通过多种途径影响细胞周期，如与去磷酸化的pRb作用，阻止其与经典E2F反应；也可与经典E2F直接作用，促进其转录活性，或削弱E2F6的转录抑制功能；还可以通过影响P27、cyclinD、CDK2等细胞周期相关蛋白而干扰细胞周期进程；此外NPM
19、、链蛋白等也是E7的作用目标。这些作用，均可能导致细胞周期进程加速，细胞不断增殖，甚至恶变。总之，E7影响细胞周期的机制极其复杂，仍有很多细节尚不清楚，有待于我们进一步探究，从而为HPV相关疾病的诊断、治疗等提供更多的理论依据。参考文献1 Liu X， Clements A， Zhao K， Marmorstein R. Structure of the human Papillomavirus E7 oncoprotein and its mechanism for inactivation of the retinoblastoma tumor suppressor. Biol ChemJ
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