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1、个体化裸鼠荷人肺癌肿瘤模型的建立王晓东 作者单位：300070 天津医科大学研究生院（王晓东，李志，白悦）；天津市胸科医院胸外科（孙大强）通讯作者 E-mail:sdqmd 孙大强 李 志 白 悦摘要 目的：建立人肺癌个体化可传代组织块动物模型。方法：组织块移植组将直径2 mm的人肺癌新鲜标本癌组织块移植于BALB/C裸鼠背部皮下组织内，每例人肺癌新鲜标本均移植入5只裸鼠体内，成瘤成功者为第一代。取第一代移植瘤组织块以相同方法移植于BALB/C裸鼠背部皮下组织内，成功者为第二代。重复上述传代方法得到第三代移植瘤。将人肺癌细胞株A549、H1795分别移植于BACL/C裸鼠背部皮下组织内，成瘤达
2、500 mm3后取癌组织块。分别取实验组的原代人肺癌肿瘤及第一、二、三代移植瘤部分组织，及作为对照的细胞系移植瘤组织，固定于10%福尔马林溶液中，石蜡包埋、切片、HE 染色，光镜下观察比较其形态异同。结果：组织块移植组瘤细胞不仅保留了人肺癌癌细胞的异型性，还保持原有排列结构；而作为对照的细胞系移植瘤细胞失去了原有的排列结构，仅保留了癌细胞的异型性。结论：利用不同患者的手术切除肺癌标本所建立的裸鼠荷人肺癌肿瘤模型具有个体化特征，能够为肺癌个体化治疗的研究提供有效工具。关键词 癌, 非小细胞肺 移植, 异种 肿瘤移植 细胞系, 肿瘤 模型, 动物 小鼠, 近交BALB/C 人类 The Estab
3、lishment of Indivudal Human Lung Cancer Model by Xenotransplant Tumor Mass in Nude MouseWANG Xiaodong ,SUN DA-qiang,Li Zhi,Bai YueTianjin Medical University Graduate School,Tianjin 300070,ChinaAbstract Objective:To establish clinically relevant individuation nude mouse models of human non-small cell
4、 lung cancer,which can be stably passaged,so as to lay a foundation for the future individualized therapy study. Methods: Tumor implanting group: BALB/C nude mouse subcutaneously injected in the back with diameter 2mm tumor derived from human operative specimens were killed when the tumor mass grown
5、 to 800mm3.This is the first generation.Then,to establish the second generation, BALB/C nude mouse were injected in the back with diameter 2mm tumor derived from first generation tumor mass.the same method redone to gain the third generation tumor. Cell lines implanting group: BALB/C nude mouse subc
6、utaneously injected in the back with 1106 human lung cancer cell lines A549 or H1795 were killed when the tumor mass grown to 500mm3.The tissue of primary human lung cancer 、first 、second 、third generation implanting tumor and the cell lines implanting group tumor were formalin-fixed、cut sections、HE
7、 stained,and then compared with the morphology by lightmicroscope.Results: The tumor cells of the tumor implanting group not only retains the atypia of cancer cells, but also keep original arrangement structure; The cell lines implanting group tumor cells lose their arrangement structure, keeping on
8、ly the atypia of the cancer cells. Conclusion: Using different surgical excision of lung cancer established human lung cancer tumor nude mice-model which have individual characteristics,this model can be useful for the future individualized therapy study in vivo. Key words carcinoma, non-small-cell
9、lung transplantation, heterologous neoplasm transplantation cell line, tumor models, animal mice, inbred BALB/C humans既往众多的肺癌模型，尤其是移植瘤肺癌模型，是将人肺癌细胞移植到动物体内传代生长，其移植的肿瘤细胞形态学特征、染色体数量、同工酶水平等仍保持不变，对临床常用抗癌药物敏感性也大致相同，所以常用来做疾病定性筛选及抗癌药物的筛选1-2。然而，其肺癌细胞多来源于建系成功的细胞株，这些细胞株经过多次体外传代，虽然能够稳定表达其原代癌细胞的特性，但是否能代表肿瘤体内生长的各种
10、特性值得商榷。加之可用于人肺癌细胞移植细胞系种类有限，且多来源于国外患者，与我国患者有人种差异，在强调肿瘤个体化治疗的今天已远远不能满足需要。近年国内外已有关于组织块移植动物模型建立的报道3-5。本研究以建立人肺癌个体化可传代组织块移植动物模型为目的，以期为患者进行个体化治疗提供药物筛选的有效工具，并为研究经过各项治疗后患者肿瘤细胞发生各种突变的情况和机制奠定基础。1 材料与方法1.1 材料 （1）实验动物。Balb/c裸鼠购自中国医学科学院实验动物研究所，先在实验室饲养12 d(空气层流室饲养，室温26 28 ，相对湿度50%)，以适应室内环境，肿瘤移植时小鼠为46周龄，体质量1520 g。
11、（2）个体化移植肿瘤来源。为天津市胸科医院手术切除的人非小细胞肺癌新鲜标本组织块。（3）细胞株移植肿瘤来源。人肺癌细胞株A549、H1795购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。1.2 个性化人肺癌肿瘤组织块种植方法 从手术切除的人肺癌新鲜标本中切取直径约1 cm左右组织块，保存于加入青-链霉素双抗的RPMI-1640培养液中，在标本获取6 h之内进行种植。超净工作台内以RPMI-1640培养液反复冲洗肺癌组织块，用剪刀将组织块修剪成直径约2 mm的小块，用25号接种针将其种植于BALB/c 裸鼠背部皮下组织内，每例人肺癌新鲜标本均移植入5只裸鼠体内，整个肿瘤组织块的制备和种植在无菌条
12、件下进行。1.3 移植后动物饲养和种植肿瘤观察 动物种植肿瘤细胞后在无特定病原体(SPF)条件下饲养,被种植同一例肺癌患者标本组织块的5只裸鼠饲养于同一笼舍之内。每日观察接种部位肿瘤生长情况，待发现肿瘤生长后，每隔3天测1次肿瘤直径，计算肿瘤体积V，V(mm3) = (Dd2)/2，D为肿瘤表面最长径，d为肿瘤表面最短径。1.4 肿瘤组织的传代 待裸鼠皮下种植的人肺癌组织块生长至肿瘤体积达到800 mm3后，处死裸鼠剥取瘤块，按1.3所述肿瘤种植方法再次植入裸鼠体内，每例标本仍移植入5只裸鼠体内。此为第二代肿瘤组织块。重复上述步骤，获得第三代肺癌组织块。1.5 肿瘤组织病理学观察 取原代人肺癌
13、肿瘤及第一、二、三代移植瘤部分组织固定于10%福尔马林中，石蜡包埋、切片、HE 染色，光镜下观察。1.6 人肺癌细胞株种植方法 人肺癌细胞株A549、H1795，用含10小牛血清的DMEM培养液，在37 、2.5CO2及饱和湿度的恒温箱培养，用0.25%.胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，台盼蓝拒染法计数活细胞数占95%以上。在裸鼠背部皮下各接种1106个（约1 mL）肿瘤细胞，3周后成瘤，生长至肿瘤体积达到500 mm3后，处死小鼠，剥取瘤块，固定于10%福尔马林中，石蜡包埋、切片、HE 染色，光镜下观察。2 结果2.1 裸鼠移植肿瘤的生长情况 共取58例人肺癌新鲜标本组织块种植于裸鼠，有14例在
14、裸鼠体内成瘤，建模成功率24.1%。第二代接种后14例肿瘤标本有12例成功传代。第三代接种后12例肿瘤标本全部成功传代。建模成功的人肺癌患者的临床资料，见表1。表1 成功建立动物模型的非小细胞肺癌患者的临床资料Tab 1 The clinical character of non-small cell lung cancer patients whose models were successfully established病例编号性别年龄（岁）分期病理诊断003男47T2N1M0，b鳞状细胞癌004男45T2N1M0，b鳞状细胞癌006男52T1N0M0，a腺癌012女72T2N0M0，b
15、腺癌015男75T1N0M0，a鳞状细胞癌018女60T2N0M0，b腺癌019男54T1N0M0，a鳞状细胞癌024男52T2N0M0，b鳞状细胞癌027女45T1N0M0，a腺癌034女64T3N2M0，a腺癌038男58T1N2M0，a鳞状细胞癌041男75T1N1M0，b鳞状细胞癌045男49T2N2M0，a腺癌046男48T1N0M0，a鳞状细胞癌2.2 移植瘤组织形态学变化 组织块和细胞系2种移植瘤均见肿瘤细胞生长，组织块移植瘤细胞保持原有排列结构，瘤细胞异型性不同，而细胞系移植瘤细胞生长失去了原有的排列结构，只保持了细胞异型性的一致，见图14。abcda：原代瘤组织； b：第1代
16、移植瘤组织； c：004号第2代移植瘤组织； d：第3代移植瘤组织图1 No.004患者及其模型瘤组织(HE200)a.original tumor of No.004 patient.b.first generation xenograft developed in Balb/c nude mouse of No.004.c.second generation xenograft developed in Balb/c nude mouse of No.004.d.third generation xenograft developed in Balb/c nude mouse of No.
17、004.Fig 1 HE staining shows histopathologic similarity between the original human tumor of No.004 and its corresponding xenografts in models b、c and d( 200)图2 H1795肺癌细胞系移植瘤组织(HE200)Fig2 HE staining shows the tumor developed from cell line H1795(200).abcda:原代瘤组织; b:第1代移植瘤组织;c:第2代移植瘤组织; d:第3代移植瘤组织图3 N
18、o.034患者及其模型瘤组织(HE200)a.original tumor of No.019 patient. b.first generation xenograft developed in Balb/c nude mouse of No.019. c.second generation xenograft developed in Balb/c nude mouse of No.019. d. third generation xenograft developed in Balb/c nude mouse of No.019Fig3 HE staining shows histopa
19、thologic similarity between the original human tumor of No.034 and its corresponding xenografts in models b、c and d.( 200).图4 A549肺癌细胞系移植瘤组织(HE200)Fig 4 HE staining shows the tumor developed from cell line A549(200).3 讨论肺癌是对人类威胁最大的疾病之一。肺癌动物模型的建立是研究癌变机制、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。利用肺癌细胞株种植于裸鼠及SCID小鼠进行异种肿瘤移植
20、已经成为建立肺癌动物模型的主要方法。目前已建成的各种肺癌细胞株，近年我国已建成很多肿瘤细胞系，并获得越来越广泛的应用6-7。但在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中是否有发生遗传性改变的可能。众所周知，长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的，另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化，其结果可能导致细胞产生生物学性状上的变动。以近年建成的各种肺癌细胞系为例，都已传代少则几十，多则百代以上后，才确认建成了细胞系，这就很难保证细胞从初代到建成时的性状仍是一致的。本研究利用人肺癌组织块种植的模型成瘤后的癌组织细胞不仅保留了原代癌细胞的异型性，还保留了细胞排列顺序的
21、一致性。而细胞的结构和排列顺序是其生物学行为的基础，因此本研究的动物模型对于进一步的个体化治疗的研究更有效。相对于其他疾病，肿瘤临床治疗的有效率目前仍然偏低。随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入，对肿瘤多成因、异质性的特点有了更加全面的认识。个体化治疗已经成为肿瘤临床治疗的发展方向和最有效的手段8-9。但是，如何识别具有相同肿瘤发生部位、相同病理类型及病期的不同患者之间存在的差异成为实施个体化治疗的主要障碍。本研究所建立的肺癌动物模型，其肿瘤来源于不同患者手术切除的标本，不再是某一个固定的细胞系。通过裸鼠成瘤实验显示生长出来瘤块的病理改变与人原发肺癌病理具有相同的组织学
22、特点和排列结构，明显优于细胞系种植后所生长的瘤块，能够更好地代表不同患者个体，具有个体化特征。建模成功的肺癌动物模型，尽管其肿瘤来源于不同患者，但均能稳定传代，为今后进行肺癌个体化治疗的系列研究提供了一个有效的工具。本肺癌动物模型的第一代建模成功率较低，其原因可能原因有：肿瘤自身的特性、肿瘤类型、组织分化、标本处理方法等不同，裸鼠的营养状态、感染情况等不同也有可能影响接种结果。另外，裸鼠虽然无T淋巴细胞，但其体液免疫仍较健全，随裸鼠成熟或既往有感染使其免疫功能成熟或激活，也会导致建模成功率较低。目前，本肺癌模型尚需进一步完善，建模成功率有待进一步提高，传代后的肺癌细胞尚需进行更多的生物学检测，
23、包括核型分析、电镜观察细胞一般结构及细胞骨架微丝微管的排列状态等。从分子细胞学角度考虑尚应检测癌基因和抗癌基因等。通过这些检测更好地证明其能够代表不同患者个体，具有个体化特征。参考文献1Weiss B,Shannon K.Mouse cancer models as a platform for performing preclinical therapeutic trialsJ. Curr Opin Genet Dev,2003, 13 (1):84-89. 2Tanaka E，Yamashita J，Hayashi N，et alA pulmonary metastatic model o
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