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1、登记序号： 计划类别： 分类代码： 项目编号： 科技项目计划设计任务书 项目名称：黄芪对腹膜透析效能及腹膜间皮细胞与腹腔免 疫功能的影响 承担单位： 单位地址： 邮编： 项目负责人： 电话： 职务职称： 主管部门： 南京市卫生局 填报日期： 2002年04月26日 江苏省科学技术厅二OO一年制一、立项依据：1、国内外研究现状、发展趋势及理论实践依据： 随着腹膜透析（Peritoneal Dialysis，PD）技术的不断提高和透析理论的日趋完善，尤其是1976年Popovich提出的连续非卧床腹膜透析（Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis，CAPD
2、）治疗方法带来了腹膜透析的空前繁荣。近年来的流行病学资料表明接受腹膜透析治疗的终末期肾功能不全（End-Stage Renal Disease，ESRD）患者正以每年7.5%的比例迅速增长，目前全球已有超过120000的患者在接受腹膜透析治疗。腹膜透析因其相对于血液透析更高的生活质量、显著的残余肾功能保护、优于或等于血液透析的生存率以及较少的资金花费，故有作者提出，腹膜透析应该是肾脏替代疗法的首选1,2。 然而，随着腹膜透析患者寿命的延长，腹膜透析的远期并发症腹膜功能衰竭已成为ESRD患者透析技术性失败的最重要的原因3，并成为制约腹膜透析发展的“瓶颈”。 资料显示约1/3的腹膜透析患者6年后因
3、腹膜功能衰竭而退出透析治疗。腹膜功能衰竭与长期腹膜透析后腹膜结构和功能破坏进而导致腹膜超滤失败以及溶质转运功能障碍密切相关4。腹膜透析液的生物不相容性是导致腹膜功能衰竭的首要原因，腹膜间皮细胞作为腹膜组成部分在这一过程中扮演着重要角色。近年来随着人腹膜间皮细胞标准培养方法和腹膜透析动物模型的确立，腹膜功能衰竭的机理得以初步阐明。腹膜间皮细胞在长期非生理性透析液刺激下，转移生长因子（TGF-）mRNA过度表达，TGF-作为细胞增殖与细胞外基质合成的重要调节因子，导致细胞外基质合成增加和腹膜纤维化5，最终导致腹膜超滤失败和溶质转运功能障碍。同时TGF-也是调节细胞凋亡的重要细胞因子，组织病理学证实
4、腹膜功能衰竭的重要特征表现为腹膜间皮细胞的丧失，过多的TGF-表达将增加间皮细胞的凋亡，导致间皮细胞的完整性受到破坏，研究表明完整的间皮细胞层可以显著延缓腹膜纤维化的进程。其次，腹膜透析的主要并发症腹膜感染也是导致腹膜功能衰竭的重要原因,反复的炎症刺激使腹膜局部高水平TGF-持续存在致使腹膜发生纤维化和硬化6。目前公认长期腹膜透析时腹腔细胞免疫功能抑制是导致腹膜反复感染的主要原因,尤其是被认为是腹腔细胞免疫功能最重要组成部分和腹膜抵抗细菌感染第一道屏障的巨噬细胞功能的明显抑制。研究表明，腹膜在长期非生理性透析液的刺激下，巨噬细胞功能受到抑制，当腹膜发生感染时透析患者腹腔巨噬细胞功能指标包括吞噬
5、指数、白细胞介素1（IL-1）和肿瘤坏死因子（TNF-）水平显著降低，如果改用更符合生理条件的透析液则可以使腹腔巨噬细胞功能得到明显增强，从而增强腹膜对感染的抵抗能力，减少腹膜炎的发生7。最近，腹膜血管在腹膜功能衰竭中的作用也得到重视，充足的血流除了能有效增强腹膜的抵抗力减少腹膜炎的发生外8，也是维持长期腹膜透析患者腹膜转运功能的重要因素。腹膜血管血流量减少时腹膜溶质转运和腹膜超滤率均显著下降9，研究显示长期腹膜透析患者腹膜血管内皮细胞依赖的血管舒张因子显著减少，从而影响腹膜透析的效能，而如在腹膜透析液中添加扩血管物质硝普纳则能有效提高腹膜透析患者的透析效果。 基于上述研究结果，近年来临床医师
6、一直致力于两方面的研究。一是研究更符合生理条件以及不影响腹膜免疫功能的全新的腹膜透析液。虽然已有诸如含多聚糖、含氨基酸、含碳酸氢根等多种透析液的体外实验的报道，但事实上所有这些透析液并不能完全替代葡萄糖作为渗透性物质的作用，其临床应用前景尚不明确。另一方面，肾脏病医师通过在现有的透析液中添加一些物质来达到保护和改善腹膜功能的目的。有研究表明在透析液中加入双嘧莫达能显著降低小鼠腹透液中TGF-的含量，而加入透明质酸可以在保护腹膜间皮细胞方面起到一定的效果。中药黄芪是一种含有多糖、甙、黄酮和微量元素等多种成分的物质，其具有多重药理作用10。黄芪能显著抑制炎症因子TGF-的表达，从而延缓肝脏、肾脏等
7、多种脏器疾病时发生纤维化的进程；能明显减缓人胚二倍体细胞自然衰老过程延长细胞寿命约1/3左右11；能有效地调节细胞免疫功能，通过向小鼠腹腔注射黄芪可以发现腹腔巨噬细胞吞噬功能得到增强，从而增强腹膜抗菌能力；黄芪还具有扩血管的作用，研究显示其能显著抑制血管收缩物质内皮素的释放，从而可能起到扩张血管增加血流量的作用12。根据黄芪的上述作用，可以推测，在腹膜透析液中加入黄芪可以起到延长腹膜间皮细胞的寿命、抑制间皮细胞TGF-的分泌、提高腹腔巨噬细胞功能、改善局部微循环，从而阻止/延缓腹膜纤维化和防止腹膜感染的发生，达到阻止/延缓腹膜功能衰竭的目的。然而关于黄芪在腹膜透析中的应用尚无相关报道。 主要参
8、考文献：1. Thodis E, Passadakis P, Vargemezis V, Oreopoulos DG.Peritoneal dialysis: better than, equal to, or worse than hemodialysis? Data worth knowing before choosing a dialysis modality. Perit Dial Int ,2001; 21:25-35.2. Van Biesen W, Vanholder R, Lameire N.The Role of Peritoneal Dialysis as the Fir
9、st-Line Renal Replacement Modality.Perit Dial Int , 2000;20: 375 - 383 3. An S. De Vriese, Siska Mortier, Norbert H,et al.What happens to the peritoneal membrane in long-term peritoneal dialysis? Perit Dial Int, 2001;Vol. 21 ;:S9-284Devuyst O,Topley N,Williams JD.Morphological and functional changes
10、 in the dialysed peritoneal cavity:impact of more biocompatible solutions.Nephrol Dial Transplant,2002;17(3):12-55.Blobe GC,Schiemann WP,Lodish HF.The role of transforeing growth factor beta in human disease.N ENGL J Med ,2000;342:1350-86Lin CY,Chen WP,Yang LY,et al.Persistent transforming growth fa
11、ctor-betal 1 expression may ptedict peritoneal fibrosis in CAPD patients with frequent peritonitis ocurrence.Am J Nephrol,1998;18:513-97.Jones S,Holmes CJ,Mackenzie RK,etal.Continuous dialysis with bicarbonate/lactate-buffered peritoneal dialysis fluids in a long-term improvement in ex vivo peritone
12、al macrophage function.J A Soc Nephrol,2002;13:S97-1038Park MS.Factors increasing severnity of peritonitis in long-term peritoneal dialysis patients.Adv Ren Replace Ther，1998；5：185-939.Ronco C,Brendolan A,Crepaldi C,et al.Ultrafiltration and clearence studies in human isolated pertoneal vascular loo
13、ps.Blood Purif,1994;12:233-4210.耿长山。黄芪的免疫药理研究进展。中西医结合杂志，1986；6：62-6411孟庆云。中国中医药发展50年。P28012伍敦裕，林海玲。黄芪注射液治疗慢性肾功能不全患者血浆内皮素变化及其意义。实用医学杂志，1998；14：6112、研究目的与意义： 研究目的： 通过体外人腹膜间皮细胞培养观察中药黄芪在抑制由高糖引起的TGF-过度表达中的作用，通过动物实验从组织病理学角度观察黄芪对腹膜间皮细胞完整性的维护和腹膜纤维化的抑制以及巨噬细胞功能调节等方面的作用，通过临床观察了解黄芪对腹膜转运功能和免疫功能的影响，从不同层面了解黄芪在阻止/延
14、缓腹膜功能衰竭中的作用及其机制，为临床上改善长期腹膜透析患者透析疗效提供一种新的治疗方法。 研究意义： 随着临床腹膜透析的广泛应用以及腹膜透析患者寿命的延长，临床上因长期腹膜透析导致腹膜功能衰竭进而透析失败的患者越来越多。中药黄芪在我国分布广泛且有2000多年的应用历史。目前临床上已有黄芪注射液制剂，并且由于黄芪可以直接注入腹腔，因此通过从不同层面了解黄芪在阻止/延缓腹膜功能衰竭中的作用及其机制的研究，在临床上推广使用黄芪来阻止/延缓腹膜功能衰竭从而延长ESRD患者腹膜透析时间、提高透析质量、减少透析失败率，提高腹膜透析远期疗效具有广泛的应用前景。3、技术查新： 参见附页。二、研究内容：研究内
15、容： 本课题采用体外细胞培养、动物实验、组织病理学与临床相结合的系统研究方法，从多个方面研究中药黄芪在防止/延缓腹膜功能衰竭中的作用，并从不同层面和角度解释其作用机理。通过体外人腹膜间皮细胞培养了解黄芪在抑制间皮细胞TGF-表达方面的作用；通过动物实验从组织病理学的角度直观了解黄芪在间皮细胞保护以及在阻止/延缓腹膜纤维化中的作用；通过临床应用，了解黄芪对腹膜转运功能以及免疫功能方面的影响。关键技术和技术难点：（1）体外人腹膜间皮细胞培养及干预方法的建立；（2）动物腹膜透析模型及干预方法的建立； （3）TGF-、TNF-免疫组化检测；（4）巨噬细胞吞噬功能的诱导及检测；（5）标准腹膜透析腹膜转运
16、功能改变的研究。课题的特色和创新之处：（1）腹膜功能衰竭是一多因素参与的病理过程，由于西药作用较为单一，因此在如何有效阻止/延缓腹膜功能衰竭的研究中显得较为局限，而中药黄芪具有多重药理作用，在阻止/延缓腹膜功能衰竭的研究中具有较大的优势。（2）由于部分药物无法进行腹腔内应用，因此以往的研究大多停留在体外试验的水平，而黄芪可以安全地应用于腹腔内注射，本课题的研究成果能够直接应用于临床。（3）通过从体外细胞培养、动物实验、组织病理学以及临床全面地对黄芪在阻止/延缓腹膜功能衰竭中的作用及机制进行研究，至今尚未见类似的研究报道。主要技术指标：（1）黄芪抑制间皮细胞TGF-分泌的指标；（2）反映巨噬细胞
17、免疫功能的TNF-分泌水平以及吞噬功能的指标；（3）黄芪对腹膜间皮细胞的维护和抑制纤维化的指标；（3）黄芪对腹膜转运功能的影响。三、研究方法及技术路线：研究工作总体思路： 本研究首先通过人腹膜间皮细胞体外培养的方法在培养基中添加黄芪观察其抑制由高糖引起的间皮细胞TGF-过度表达中的作用，了解黄芪与腹膜间皮细胞TGF-表达之间的关系。然后通过腹膜透析动物模型从组织病理学角度直观了解黄芪对腹膜间皮细胞损伤的保护以及抑制腹膜纤维化方面的作用。最后通过在临床上的应用了解黄芪对腹膜转运功能以及腹膜免疫功能的影响，并探讨其作用机制。从而为临床上阻止/延缓长期腹膜透析患者因腹膜纤维化、腹膜反复感染导致的腹膜
18、功能衰竭提供新的治疗方法。技术路线：（1）体外细胞培养部分： 从择期手术小网膜切除的标本获得人网膜组织，按照文献方法培养间皮细胞，通过调整原代（1-9代）人腹膜间皮细胞培养液中葡萄糖浓度，在1.5%、4.5%葡萄糖条件下观察添加与不添加黄芪对腹膜间皮细胞TGF-表达的影响，TGF-用免疫组化方法检测。（2）动物模型部分： 按照标准腹膜透析小鼠动物模型建立方法建立小鼠腹膜透析模型，分别采用添加和不添加黄芪的葡萄糖浓度为1.5%、4.5%的透析液进行腹膜透析，8周后取小鼠腹膜组织，10%甲醛溶液固定、脱水、 石蜡包埋后HE、PAS、PASM染色，在光学显微镜下进行病理组织学检查。（3）临床部分：
19、在临床上选择长期腹膜透析患者，采用自身对照的方法观察添加黄芪前后患者腹膜转运功能和患者透析液中TNF-浓度以及巨噬细胞吞噬功能的变化。（4）总结资料，分析结果。研究方法：（1）组织细胞培养方法。（2）动物实验学研究方法。（3）组织病理学方法。（4）生化分析方法。四、现有研究条件和工作基础：1、现有工作基础： -临床上有大量的长期腹膜透析的随访病人。研究者已成功掌握了人腹膜间皮细胞培养方法和腹膜透析小鼠动物模型建立方法，具备了TGF-、TNF-的检测能力，以及本研究所需的组织病理学检查条件。同时在预实验中已经得出黄芪能有效抑制体外培养人腹膜间皮细胞TGF-的表达。因此，本研究具有很强的可行性和较
20、高的成功率。2、项目负责人近年来研究成绩简介 近年发表相关论文： 近年研究成果：3、研究队伍： 4、支撑条件： 五、计划进度：1、总进度和年度进度： 2003.012003.03课题准备，订购动物与试剂。 2003.042003.06细胞培养研究部分。 2003.062003.12动物实验部分。 2003.062004.09临床部分。 2004.092004.12总结资料，分析结果，科研鉴定。2、项目完成形式：（1）项目完成可通过论文形式考察，预计可在核心期刊发表论文4-6篇。（2）细胞培养研究部分通过对TGF-表达的检测可以了解高糖在腹膜间皮细胞TGF-表达中作用，了解黄芪在拮抗TGF-过度
21、表达中的作用。（3）动物实验部分通过腹膜组织病理学检查了解黄芪对腹膜间皮细胞损伤的保护以及抑制腹膜纤维化方面的作用，可通过病理切片形式表达。（4）临床研究部分可通过治疗前后患者TGF-、TNF-水平以及巨噬细胞吞噬功能了解腹膜功能的改变，用差异性来表示。（5）通过成果考核。（6）成果可达到国际先进水平。六、项目研究预期成果及效益：预期达到的主要技术指标：（1）黄芪有效抑制体外培养人腹膜间皮细胞的TGF-的分泌。（2）应用黄芪后在腹膜透析动物模型腹膜组织病理检查中发现黄芪能维护腹膜间皮细胞的完整性和抑制腹膜纤维化的发生。（3）黄芪能改善腹膜透析病人的腹膜转运功能和增强巨噬细胞的免疫功能。（4）该
22、研究成果预期达到国际领先水平，为临床上阻止/延缓腹膜功能衰竭提供新的治疗方法。 经济效益和社会效益：通过本课题的系列研究，预期可以明确黄芪有效阻止/延缓长期腹膜透析病人腹膜功能衰竭的进程，从而延长腹膜透析时间、提高腹膜透析质量。从经济效益来讲，腹膜透析是一种价格低廉的肾脏替代疗法，长期的腹膜透析必将大大减轻社会及其个人的经济负担。从社会效益来讲，腹膜透析具有较高的生活质量，可以使ESRD病人重返社会并参加力所能及的工作，产生积极的社会效应。并且，通过此疗法的成功也可以提升中药治疗在国际上的影响。七、承担项目单位及分工 八、经费概算及来源：经费预算总额及分类科 目名 称单价（万元）数 量主要依据
23、金额（万元）业 务 费文献检索论文发表科研鉴定30实验材料胰蛋白水解酶01092/100l200l细胞培养022小牛血清003/100ml1000ml细胞培养030RMPI1640培养基0009/500ml2000ml细胞培养004HAM-12培养基0014/500ml5000 ml细胞培养014抗细胞角蛋白抗体0242/100l200l细胞培养050抗波形蛋白抗体0242/100l200l细胞培养050抗因子抗原抗体0166/100l200l细胞培养040抗CD45抗体035/100l200l细胞培养070TGF-单克隆抗体025/96次2生化检测050TNF-单克隆抗体0185/96次2生化检测040细菌脂多糖0126/100g200g免疫诱导025黄芪注射液150腹膜透析液300其他试剂100病理检查150动物实验小鼠动物实验100其 他临床标本收集200总 计： 17 万元，其中自筹： 万元，申请拨款 17 万元九、研究人员：姓 名单 位性别出生年月专 业专业技术职务承担工作签章项目主要负责人参加项目研究人员十、承担单位审查及承诺意见、盖章 第一承担单位 第二承担单位 （法人签字） （法人签字） 盖章 盖章 年 月 日 年 月 日十一、协作单位及审查承诺意见、盖章 （法人签字） 盖章 年 月 日 十二、项目主管部门审查承诺意见、盖章 盖章 年 月 日
