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1、鱼油多不饱和脂肪酸的制备方法!里海洋药物杂志2005年2月第24卷第1期ChinJMarDrugs,2005nn,z.24N0.I?综述?鱼油多不饱和脂肪酸的制备方法张天民,郭学平,荣晓花(1.山东大学药学院,山东济南250012;2.山东省生物药物研究院,山东济南250014)摘要:结合作者的实验研究和生产实践,综述鱼油多不饱和脂肪酸的制备方法.关键词:鱼油;多不饱和脂肪酸;制备方法中图分类号:R931.77TQ460.6文献标识码:A文章编号:10023461(2005)01004303Preparationmethodsofp0lyunsaturatedfattyacidsfromfis
2、hoilsZHANGTianrain,GUOXue-ping.,RONGXiaohua.(1.SchoolofPharmacy,ShangdongUniversity,Jinan250012,China;2.InstituteofBiopharmaceuticalsofShangdongProvince,Jinan250014,China)Abstract:Beinglinkedtoexperimentalresearchandmanufacturepractice,thepreparationmethodsofpolyunsaturatedfattyacidsfromfishoilswere
3、reviewedinthisarticle.Keywords;fishoil;polyunsaturatedfattyacid;preparationmethod鱼油中富含多种多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid,PUFA),其中二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)为重要的也是研究最多的鱼油PUFA1.研究证明EPA,DHA等n-3系PUFA为人体所必需的脂肪酸,具有多种药理作用和生理功能.PUFA主要以甘油三酯的形式存在于海洋生物中,目前商品PUFA制剂一般是先从海鱼或其
4、下脚料中提取鱼油,再经分离纯化制取PUFA,将其做成滴丸或胶丸.本文结合作者的实验研究和生产实践,就鱼油PUFA的主要制备方法作一介绍.1鱼油的制备1.1制备工艺取鱼下脚料,绞碎,加1/2量水,调pH至8.59.0,在搅拌下加热至8590C,保持45min后,加5的粗食盐,搅拌使溶,继续保持15min用双层纱布或尼龙布过滤,压榨滤渣,合并滤液与压榨液,趁热离心即得鱼油.1.2工艺说明鱼油的制取原料可以是整鱼,也可以是鱼加工中的下脚料.这些原料必须是新鲜或冷藏的.本工艺采用加工鱼罐头剔除的下脚料,用其他原料的制取工艺,与本工艺类似.在鱼油的提取过程中,将提取液调至碱性并在加热保温后期加入食盐,可
5、使提取液黏性变小,渣子凝聚,过滤压榨容易进行,但加碱不可过量,否则鱼油将被皂化.另外食盐还有破乳化作用,有利于油水分离.压榨对鱼油收率影响很大,约有1/31/2的鱼油存在于压榨液中.大规模生产应使用连续进料出料和排渣的工业离心分离机.2鱼油PUFA的制备2.1低温钠盐结晶法分离纯化PUFA2.1.1制备工艺.?43ChinJMarDrugs,2005Feb,uary,z.24No.1中国海洋药物杂志2005年2月第24卷第1期将鱼油加至5倍体积4(w/v)氢氧化钠乙醇(95)溶液中,在氮气流下回流1020min,进行皂化.用硅胶G薄层色谱法检查皂化程度,以甘油三酯斑点消失判定皂化完全.脂肪酸甘
6、油三酯被皂化成脂肪酸钠盐后,溶于热乙醇中.冷却至室温,大量饱和脂肪酸钠盐析出,挤压过滤,得滤液.滤液冷却到一20,压滤.滤液加等体积水,用稀盐酸调pH至34,2000g离心10rain,得上层多不饱和脂肪酸PUFA.将所得PUFA溶于4倍体积氢氧化钠乙醇溶液中,-20放置过夜,压滤.滤液加少量水,一10冷冻,抽滤除去胆固醇结晶.滤液再加少量水,-20冷冻,2000g离心5min,倾出上层液,得下层PUFA钠盐胶状物.将PUFA钠盐胶状物,用稀盐酸调pH至23,2000g离心10min,得上层液即为纯化的PUFA.2.1.2工艺说明鱼油在80乙醇中皂化后,冷却至室温无脂肪酸钠盐析出,再冷却至一2
7、O,整个皂化液冻结成硬块,无分离纯化作用.所以乙醇的含量很重要,宜在9O以上.在纯化过程中,将第一次一2O冷冻,酸化离心后获得的脂肪酸溶于氢氧化钠乙醇溶液,与第一步冷却除钠盐结晶后的滤液相比,脂肪酸钠的浓度大大提高,再冷却还会析出低度不饱和脂肪酸钠盐,除去这部分钠盐,EPA和DHA得到进一步纯化.向PUFA的碱性乙醇溶液中加入适量的水,可除去PUFA中的胆固醇.再加入适量的水,冷却至一2O,由于乙醇浓度降低,PUFA钠盐析出,而色素等杂质溶解于母液中,所以此步骤还有脱色作用.2.2尿素包合(ureainclusion)法制备鱼油PUFA2.2.1制备工艺_4将氢氧化钾25kg溶于95乙醇800
8、L,加入鱼油100kg,在氮气流下加热回流2O60min,使完全皂化.皂化液加适量的水,用?44?1/3体积的石油醚萃取非皂化物,分离去石油醚层,蒸馏回收石油醚.下层皂化液加2倍体积水,用稀盐酸调至pH23,搅拌,静置分层,收集上层油样液,以无水硫酸钠干燥得混合脂肪酸.取尿素2OOkg加甲醇1000L,加热溶解后在搅拌下加入混合脂肪酸100kg,加热搅拌使澄清,置室温继续搅拌3h,静置24h,抽滤,弃去沉淀(尿素饱和脂肪酸包合物,去除饱和脂肪酸),得滤液.向滤液再加入尿素甲醇饱和溶液300L(含尿素5Okg),搅拌,室温静置过夜,于-20.C再静置24h,抽滤,弃去沉淀(尿素,饱和脂肪酸和低度
9、不饱和脂肪酸包合物),得滤液.用稀盐酸将滤液调至pH23,搅匀后静置,收集上层液,水洗,无水硫酸钠干燥得PUFA.2.2.2工艺说明在相同温度条件下,尿素用量较小时,饱和度高的脂肪酸优先形成包合物而沉淀;尿素用量较大时,1个和2个双键的脂肪酸也形成包合物析出.在尿素与脂肪酸物质的比例相同条件下,温度降低有利于包合物的形成.随着温度下降,低度不饱和脂肪酸形成的包合物逐渐增多.EPA和DHA的甲酯或乙酯也可用尿素包合法进行纯化.产品为PUFA的乙酯时,上述尿素包合过程中应采用乙醇代替甲醇,工艺条件要适当调整.钠盐结晶法和尿素包合法除去低度不饱和脂肪酸的机制不同,各有所长.钠盐结晶法除去CC.低度不
10、饱和脂肪酸效果较好,尿素包合法除去C.C低度不饱和脂肪酸较为优越,故两种方法联合应用,可进一步提高产品EPA和DHA含量.2.3鱼油PUFA乙酯的制备将PUFA加至4倍体积1.5(w/v)硫酸乙醇液中,回流90min,硫酸作为酯化反应催化剂.放至室温,加等量水,搅拌2min,3000r?min离心10min,洗除片状结晶.中国海洋药物杂志2005年2月第24卷第1期ChinJMarD九gs,2005九n,z.24N0.1重复水洗数次,至洗液呈淡黄色为止,得PUFA乙酯.2.4酯交换(esterexchange)反应制备PUFA乙酯鱼油80kg和乙醇50kg加入密闭的反应罐中,加入硫酸2.5kg
11、作为催化剂,氮气保护下,82加热回流约6h.用薄层色谱确定酯交换反应终点.反应完毕,冷至室温,加水200kg和环己烷150kg,搅拌,静置,弃去水相.水洗环己烷层数次至中性,用无水硫酸钠脱水,最后真空蒸发脱去环己烷,制得鱼油PUFA乙酯.该方法鱼油可与乙醇直接进行酯交换反应5,省去了皂化反应步骤.2.5分子蒸馏(moleculardistillation)法纯化PUFA分子蒸馏法是目前工业化生产高纯度EPA和DHA最常用的方法之一.PUFA(混合物)进行分子蒸馏之前,要先进行甲酯或乙酯化,以降低其极性,提高挥发性.EPA乙酯的沸点低于DHA乙酯,分子蒸馏时可先被蒸馏出来,而DHA乙酯留在未蒸发
12、的残留物中,因此可实现EPA和DHA的有效分离,使其含量分别达到8O以上.分子蒸馏还有除臭作用,可去除鱼腥味.美国专利5报道了用酯交换反应制得脂肪酸乙酯,再用尿素包合法和分子蒸馏法等进行纯化,制得DHA含量达96的产品.由此可知,将酯交换,分子蒸馏,尿素包合等方法灵活运用,以生产不同规格的EPA,DHA产品,并降低生产成本,是很重要的.2.6涂银色谱法(argentationchromatography)纯化PUFA取含硝酸银2O的硅胶150g,用石油醚浸泡1h左右,不断搅拌排除气泡,然后将其转移至色谱柱中,静置23h,达到平衡后再使用,柱外包黑纸遮光.取PUFA乙酯(本实例含EPA乙酯68.
13、63,DHA乙酯8.30)15g加到色谱柱上部的石油醚中,溶解后从柱下放出适量液体,使上部液体进入柱床,再进行洗脱.洗脱液为石油醚一醋酸乙酯一乙醇(1:1:0.025,v/v),流速1.80.8mL?rain_.,每隔1h分瓶收集洗脱液,分别用气相色谱法检测EPA乙酯和DHA乙酯的含量.洗脱液经检测不含PUFA乙酯时停止洗脱.将显示EPA乙酯和DHA乙酯单峰的流分分别合并,用真空蒸馏除去溶剂,加入饱和氯化钠水溶液50mL,振摇lmin,静置分层,除去下层氯化银沉淀与废液,再加15氯化钠水溶液洗涤两遍,每次50ml,最后用蒸馏水50mL洗一次,经无水硫酸钠过滤脱水,称重.结果制得EPA乙酯3.8
14、6g,含量97.7O;DHA乙酯0.53g,含量97.67.如进一步处理,可制得纯度更高的产品.以涂银色谱法制得的高纯度EPA和DHA,可作为有关药品含量测定的对照品使用6,7l.参考文献:1DyerbergJ,BangHO,StoffersenE,eta1.EicosapentaenoicacidandpreventionofthrombosisandatherosclerosisJ.Lancet,1978,2(8081):117.2郭凤仙,张天民,李恩川.鱼油多烯脂肪酸乙酯胶丸的制备及其药物动力学EJ.中国海洋药物,1991,10(1):7.3郭学平,张天民,张子刚.鱼油多烯脂肪酸的研制J
15、.中国海洋药物,1988,7(3):4.4贺艳丽,张天民,张子刚.鱼油多不饱和脂肪酸乙酯的制备和生物活性J.山东医科大学,1988,26(2):73.5CornieriFD,FulvioW.ProcessfortheextractionofpolyunsaturatedfattyacidestersfromfishoilsP.US5130061.19920714.6李恩川,高玉忠,张天民,等.高纯度二十碳五烯酸乙酯的制备J.药物生物技术,1997,4(4):229.7李恩川,高玉忠,张天民,等.高纯度二十二碳六烯酸乙酯的涂银层析制备J.中国医药工业杂志,1998,29(11):483.(收稿日期:20040706)?45?
