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1、头孢丙烯中有关物质检查的HPLC法?研究与交流?2009年第33卷第1期第34页doi:10.3969/j.issn.10015094.2009.01.007药学进展342009,VoL33,No.1头孢丙烯中有关物质检查的HPLC法刘文华,张国成(东瑞制药有限公司研发中心,江苏苏州215128)摘要】目的:建立头孢丙烯中有关物质的检测方法.方法:采用高效液相色谱法,固定相为C.柱,流动相为乙腈一磷酸二氢铵溶液(10:90),检测波长为280hill.结果:头孢丙烯与各有关物质达到了较好的分离,顺式异构体和反式异构体峰的相对保留时间分别为0.7和1.0,分离度大于2.5.3批样品的中间体杂质含
2、量分别为0.14%,0.15%和0.15%,其它最大单个杂质含量分别为0.38%,0.39%和0.36%,杂质总量分别为1.20%,1.15%和1.18%.结论:本法简便,专属性强,准确度高,重复性好,可用于测定头孢丙烯中的有关物质.关键词头孢丙烯;有关物质;HPLC中图分类号R927.1文献标识码B文章编号10015094(2009)01003404DeterminationofRelatedSubstancesinCefproziIbVHPLCLIUWenhua,ZHANGGuocheng(ResearchandDevelopmentCenter,SuzhouDawnraysPharmac
3、euticalCo.,Ltd.,Suzhou215128,China)【Abstract】Objective:ToestablishasuitablemethodforthedeterminationofrelatedsubstancesincefrlrozilbyRPHPLC.Methods:TheC18column(250nlnlx4.6mm,5I.Lm)andtheacetonitrilephosphatebufferssolution(10:90)wereused,andthedetectionwavelengthwasat280nm.Results:Theresolutionbetw
4、eencefprozilandtherelatedsubstanceswasidea1.ThreebatchesofsamplesweretestedandtheCOntentoftheknownrelatedsubstanceswas0.14%,0.15%and0.15%,respectively.Thecontentoftheothermaximumindividualimpuritywas0.38%,0.39%and0.36%,respectivelyandthetotalcontentwas1.20%,1.15%and1.18%,respectively.Conclusion:This
5、methodissimpleandaccurate.Itmaybeusedtodeterminetherelatedsubstancesincefprozil.【Keywords】cefprozil;relatedsubstances;HPLC头孢丙烯是第二代口服头孢类抗生素,具有高效,低毒,耐酶,广谱的特点,对革兰阳性菌,革兰阴性菌,厌氧菌的抗菌活性强,其中对革兰阳性菌活性尤为突出.本文参考美国药典,采用乙腈一磷酸二氢铵溶液(10:90)为流动相,测定头孢丙烯中有关物质,并进行了方法验证.1仪器与试药Agilentl100型高效液相色谱仪(DAD检测器,Agilent色谱工作站).接受日期2
6、008.09.09头孢丙烯原料药(以下简称本品,由苏州东瑞制药有限公司研制,批号分别为20020601,20020602,20020603);乙腈为色谱纯,磷酸二氢铵,磷酸及其它试剂均为分析纯.2方法与结果2.1色谱条件色谱柱:AlltechCl8柱(250mln4.6mm,5Ixm);流动相为乙腈磷酸二氢铵溶液(1O:9O),其制备方法为:取磷酸二氢铵2O.7g,加水溶解并稀释通讯作者:刘文华,副主任药师;研究方向:新药研究与开发;Tel:051265626868-3102;E-mail:1whdawnrays.corn2009,VoL33,No.135ProgressinPharmaceu
7、ticalSciences药学莲履至1800mL,用磷酸调节至pH4.4J,检测波长为280nm,流速为ImL?rain,进样量为10L.2.2检测波长的选择分别取合成起始原料和中间体(含顺,反式异构体)适量,以流动相制成每1mL含0.3mg的起始原料溶液和中间体溶液;分别取顺式,反式头孢丙烯各适量,以流动相制成1.5g?L的顺式头孢丙烯溶液和反式头孢丙烯溶液;取本品75mg,置50mL量瓶中,加人1mL4.O%氢氧化钠溶液,混合1分钟,用盐酸调节pH至中性,再加流动相稀释至刻度,摇匀,滤过,制得碱破坏液;取本品75mg,置5OmL量瓶中,加入1mL盐酸,混合IO分钟后,用4.0%氢氧化钠溶液
8、调节pH至中性,再加流动相稀1600l2003800E400O2002503003504002/nm504O三oE20100l050.5-10-15.20400?研究与交流?2009年第33卷第1期第35页释至刻度,摇匀,滤过,制得酸破坏液;取本品75mg,加流动相制成1.5g?L的溶液,在强光(6000Lx)下照射5小时,滤过,制得强光照射破坏液;取本品75mg,置50mL量瓶中,加入lmL过氧化氢,混合75分钟,加流动相稀释至刻度,摇匀,滤过,制得氧化破坏液;取本品75mg,置50mL量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,置人60cI=水浴中90分钟,取出,放冷,滤过,制得湿热破坏液.取上述各
9、溶液,分别注入带有DAD检测器的液相色谱仪中,记录色谱图,并扫描uV图,结果表明,除末端吸收外,起始原料,中间体,本品及其降解产物在280nm波长处有最大或较大吸收,如图1所示.故选择280nm作为检测波长.lOO8O60402002002503003504002/nm200I501005O02002503003504002/nml0008006o0400200OMnm2/nmA:起始原料;B:中间体(顺式);C:中间体(反式);D:头孢丙烯(顺式);E:头孢丙烯(反式);F:酸破坏液(3.855min);G:酸破坏液(15.114min);H:酸破坏液(19.237min);I:碱破坏液(5
10、.188min);J:强光破坏液(13.521min);K:氧化破坏液(2.964min);L:氧化破坏液(5.188min);M:氧化破坏液(4.161min);N:湿热破坏液(4.025min)图1头孢丙烯有关物质紫外全波长扫描图FigurelUVt0talwavelengthscanningspectrumoftherelatedsubstancesincefDrozil2009-(-136药学进履第33卷第期第页.2.3系统适用性取本品适量,以流动相制成1.5g?L的溶液,按2.1项下色谱条件,注入液相色谱仪中,记录色谱图,顺式异构体和反式异构体峰的相对保留时间分别为0.7和1.0,分
11、离度大于2.5,理论塔板数按顺式头孢丙烯峰计算不小于2500.2.4专属性试验分别取合成起始原料,中间体及本品溶液各5mL,混合均匀,制成原混合溶液,按2.1项下色2502003150<E1O05OO706O50403O2O1O01lA墨JL._-O5l0l520min706O5040302O1O0362009,Vo/.33,No.1ProgressPharmaceuticalSciences谱条件,取10L进样,结果如图2所示.出峰顺序为起始原料,中间体(顺式),中间体(反式),头孢丙烯(顺式),头孢丙烯(反式).分别取2.2项下的酸,碱,强光,氧化及湿热破坏液进样,记录色谱图至主成分
12、峰保留时间的3倍,并对出现的主要杂质进行DAD扫描,在各条件下,因破坏而出现的杂质峰均能与主峰有效分离,起始原料,中间体与头孢丙烯也有较好的分离度(见图2),表明该法测定头孢丙烯中有关物质的专属性良好.:.B:.,.一一105lOl52O25f,mIn圣0一C,O5l0152O25t/min三:F:-兽05lOI52025l|rainA:混合溶液;B:酸破坏液;C:碱破坏液;D:强光照射破坏液;E:氧化破坏液;F:湿热破坏液图2头孢丙烯专属性试验色谱图Figure2Chmmatoamsofspecialitytestofcefprozil2.5溶液稳定性取2.3项下的溶液,按2.1项下色谱条件
13、,分别于0,2,4小时进样,记录色谱图,以面积归一化法计算,测得最大单个杂质含量和杂质总量分别为0.37%和1.21%(0h),0.37%和1.23%(2h),0.38%和1.18%(4h),表明供试品溶液在4小时内稳定.2.6重复性试验按2.3项下方法分别配制6份溶液,按2.1项下的色谱条件,分别进样,记录色谱图,以面积归一化法计算,测得最大单个杂质含量和杂质总量的平均值分别为0.35%和1.18%,RSD分别为0.5%和0.6%,表明方法重复性较好.2.7检测限分别取合成起始原料,中间体及头孢丙烯适量,精密称定,置50mL量瓶中,用流动相溶解并稀释制成一系列浓度的溶液,分别进样,记录色谱图
14、.按信噪比3:1计算,起始原料,中间体,顺式及反式头孢丙烯的检测限分别为0.38,0.15,0.24和0.16ixg?mL.如如加m0舳加如如加02oo9,Vo1.33,No.137ProgressinPharmaceuticalSciences药学莲展2.8线性关系分别取合成起始原料和中间体适量,精密称定,置同一量瓶中,以流动相制成0.5g?L的溶液,以此溶液作为贮备液,然后梯度稀释成各浓度溶液,并分别进样,记录色谱图,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线,其起始原料的线性方程和相关系数分别为:A=3422.36C+0.09157,r=0.99997;顺式中间体为A=18677.36C
15、+1.99457,r=0.99998.结果表明,该色谱条件下,起始原料在1.55一l5.5ixg?mL,顺式中间体在3.9439.4txg?mL均有较好的线性关系.2.9校正因子分别取合成起始原料和中间体及头孢丙烯适量,精密称定,置同一量瓶中,以流动相制成0.3g?L的溶液,平行制备3份;精密量取每份溶液适量,用流动相稀释1O倍和100倍,共9份溶液,分别进样,记录色谱图,测定峰面积,计算各校正因子.结果上述3种物质的平均校正因子分别为2.81210I4,5.45010.,6.82910,故合成起始原料和中间体相对于头孢丙烯的相对校正因子分别为4.12和0.80.2.10样品检查采用加校正因子
16、的主成分自身对照法控制有关物质.取本品适量,用流动相溶解并稀释制成1.5g?L的溶液,作为供试品溶液.精密量取lmL,置100mL量瓶中,以流动相稀释至刻度,作为对照溶液.称取合成起始原料和中间体各少量,分别以流动相制成0.3g?Lg的溶液,作为定位溶液.按照2.1项下色谱条件,取对照溶液进样,调节仪器灵敏度,使主成分峰的峰高约为满量程的?研究与交流?2009年第33卷第1期第37页10%一25%;取定位溶液进样,确定特定杂质的出峰时间;取供试品溶液进样,记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍.供试品溶液色谱图中如显合成起始原料峰或中间体峰,则分别按校正因子4.12和0.80计算峰面积,二者均不得
17、大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5%);如显其它杂质峰,单个最大杂质峰面积不得大于对照溶液的主峰面积(1.O%);各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的2倍(2.0%).3批样品(批号:20020601,20020602,20020603)的相关物质测定结果如下:起始原料均未检出;中间体含量分别为0.14%,0.15%,0.15%;其它最大单个杂质含量分别为0.38%,0.39%,0.36%;杂质总量分别为1.20%,1.15%,1.18%,符合要求.3讨论采用加杂质校正因子的主成分自身对照法,既保证了对特定杂质的准确定量,又可避免后期不断制备高纯度杂质对照品的麻烦.试验发现,流动相中乙腈比例的减少,有助于改善头孢丙烯顺反异构体及起始原料,中间体之间的分离度,但头孢丙烯主峰的保留时间则有所增加.参考文献1TheUnitedStatesPharmacopeiaConvention,Ine.UnitedStatesPharmacopeia.23ndrevisionM.RockviUeMD:Randmenally,1995:307.2国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)M.北京:化学工业出版社,2000:附录34.
