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1、内科学专业毕业论文 精品论文 肝衰竭时肝细胞高迁移率族蛋白1的移位及释放研究关键词：肝衰竭 重型肝炎 高迁移率族蛋白-1 肝细胞HMGB1 细胞因子 TNF- 免疫荧光摘要：肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis Bvirus，HBV)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，HMGB1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明HMGB1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞HMGB1的移
2、位及释放情况。 目的：(1)研究LPS或TNF-，刺激是否可引起肝细胞HMGB1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞HMGB1移位；(3)研究D-GaIN+LPS诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞HMGB1移位；(4)初步探讨肝细胞HMGB1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度LPS或TNF-刺激肝细胞系HepG2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。MTT法测定细胞存活率，TUNEL法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的LDH含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。Western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中HM
3、GB1的含量，免疫荧光技术观察HMGB1移位。ELISA，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察HMGB1在肝细胞中的分布情况。同时行HE染色，评估肝组织的病理学改变。(3) D-GaIN联合LPS腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于D-GalN+LPS注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行HMGB1的免疫组织化学染色。(4)用Western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素B(LMB)和曲古霉素(TSA)对LPS诱导的肝细胞HMGB1移位和释放的影响。 结果：(1)体
4、外用LPS或TNF-刺激可诱导HepG2细胞释放HMGB1，释放到上清中的HMGB1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到HepG2细胞胞核中的HMGB1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，LPS(400ng/mL)或TNF-(25ng/mL)诱导的HMGB1分泌量随LPS或TNF-剂量增加而增加。MTT，TUNEL检测及上清中LDH含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白Westem blotting分析亦证实了细胞浆中的HMGB1表达增强。ELISA和细胞因子抗体芯片检测表明LPS，TNF-或重组HMGB1刺激HepG2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释
5、放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的HMGB1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞HMGB1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) D-GalN+LPS注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(P<0.01)。(4)体外CRM1抑制剂LMB可以显著减少LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的释放，及HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可以促进LPS诱导的HMGB1释放，促进HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) LPS或TNF-a可
6、时间及剂量依赖性诱导体外培养的HepG2细胞核蛋白HMGB1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在HMGB1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)D-Gal+LPS诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞HMGBI存在从细胞核向胞浆的移位。(4)LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的移位和释放可能存在CRM1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。正文内容 肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis Bvirus，HBV)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility gro
7、up box-1protein，HMGB1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明HMGB1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞HMGB1的移位及释放情况。 目的：(1)研究LPS或TNF-，刺激是否可引起肝细胞HMGB1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞HMGB1移位；(3)研究D-GaIN+LPS诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞HMGB1移位；(4)初步探讨肝细胞HMGB1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度LPS或TNF-刺激肝细胞系HepG2细胞
8、，不同时间点分别收集细胞和培养上清。MTT法测定细胞存活率，TUNEL法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的LDH含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。Western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中HMGB1的含量，免疫荧光技术观察HMGB1移位。ELISA，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察HMGB1在肝细胞中的分布情况。同时行HE染色，评估肝组织的病理学改变。(3) D-GaIN联合LPS腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于D-GalN+LPS注射后3h处
9、死动物，收集肝脏组织，进行HMGB1的免疫组织化学染色。(4)用Western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素B(LMB)和曲古霉素(TSA)对LPS诱导的肝细胞HMGB1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用LPS或TNF-刺激可诱导HepG2细胞释放HMGB1，释放到上清中的HMGB1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到HepG2细胞胞核中的HMGB1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，LPS(400ng/mL)或TNF-(25ng/mL)诱导的HMGB1分泌量随LPS或TNF-剂量增加而增加。MTT，TUNEL检测及上清中LDH含量测定排除了细
10、胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白Westem blotting分析亦证实了细胞浆中的HMGB1表达增强。ELISA和细胞因子抗体芯片检测表明LPS，TNF-或重组HMGB1刺激HepG2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的HMGB1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞HMGB1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) D-GalN+LPS注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(P<0.01)。(4)体外CRM1抑制剂LMB可以显
11、著减少LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的释放，及HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可以促进LPS诱导的HMGB1释放，促进HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) LPS或TNF-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的HepG2细胞核蛋白HMGB1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在HMGB1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)D-Gal+LPS诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞HMGBI存在从细胞核向胞浆的移位。(4)LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的移位和释放可能存在CRM1依赖的核转运，可能与
12、乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis Bvirus，HBV)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，HMGB1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明HMGB1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞HMGB1的移位及释放情况。 目的：(1)研究LPS或TNF-，刺激是否可引起肝细胞HMGB1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝
13、细胞HMGB1移位；(3)研究D-GaIN+LPS诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞HMGB1移位；(4)初步探讨肝细胞HMGB1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度LPS或TNF-刺激肝细胞系HepG2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。MTT法测定细胞存活率，TUNEL法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的LDH含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。Western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中HMGB1的含量，免疫荧光技术观察HMGB1移位。ELISA，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，
14、免疫组织化学染色观察HMGB1在肝细胞中的分布情况。同时行HE染色，评估肝组织的病理学改变。(3) D-GaIN联合LPS腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于D-GalN+LPS注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行HMGB1的免疫组织化学染色。(4)用Western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素B(LMB)和曲古霉素(TSA)对LPS诱导的肝细胞HMGB1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用LPS或TNF-刺激可诱导HepG2细胞释放HMGB1，释放到上清中的HMGB1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到HepG2细胞胞核中
15、的HMGB1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，LPS(400ng/mL)或TNF-(25ng/mL)诱导的HMGB1分泌量随LPS或TNF-剂量增加而增加。MTT，TUNEL检测及上清中LDH含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白Westem blotting分析亦证实了细胞浆中的HMGB1表达增强。ELISA和细胞因子抗体芯片检测表明LPS，TNF-或重组HMGB1刺激HepG2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的HMGB1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞HMGB1集中分布于细
16、胞核中，未见明显的移位。(3) D-GalN+LPS注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(P<0.01)。(4)体外CRM1抑制剂LMB可以显著减少LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的释放，及HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可以促进LPS诱导的HMGB1释放，促进HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) LPS或TNF-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的HepG2细胞核蛋白HMGB1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在HMGB1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及
17、正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)D-Gal+LPS诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞HMGBI存在从细胞核向胞浆的移位。(4)LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的移位和释放可能存在CRM1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis Bvirus，HBV)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，HMGB1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明HMGB1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥
18、重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞HMGB1的移位及释放情况。 目的：(1)研究LPS或TNF-，刺激是否可引起肝细胞HMGB1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞HMGB1移位；(3)研究D-GaIN+LPS诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞HMGB1移位；(4)初步探讨肝细胞HMGB1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度LPS或TNF-刺激肝细胞系HepG2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。MTT法测定细胞存活率，TUNEL法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的LDH含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。Western blott
19、ing方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中HMGB1的含量，免疫荧光技术观察HMGB1移位。ELISA，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察HMGB1在肝细胞中的分布情况。同时行HE染色，评估肝组织的病理学改变。(3) D-GaIN联合LPS腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于D-GalN+LPS注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行HMGB1的免疫组织化学染色。(4)用Western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素B(LMB)和曲古霉素(TSA)对LPS诱导
20、的肝细胞HMGB1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用LPS或TNF-刺激可诱导HepG2细胞释放HMGB1，释放到上清中的HMGB1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到HepG2细胞胞核中的HMGB1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，LPS(400ng/mL)或TNF-(25ng/mL)诱导的HMGB1分泌量随LPS或TNF-剂量增加而增加。MTT，TUNEL检测及上清中LDH含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白Westem blotting分析亦证实了细胞浆中的HMGB1表达增强。ELISA和细胞因子抗体芯片检测表明LPS，TNF-或重组HMGB
21、1刺激HepG2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的HMGB1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞HMGB1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) D-GalN+LPS注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(P<0.01)。(4)体外CRM1抑制剂LMB可以显著减少LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的释放，及HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可以促进LPS诱导的HMGB1释放，促进HMGB1从细胞核
22、向细胞浆的移位。 结论：(1) LPS或TNF-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的HepG2细胞核蛋白HMGB1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在HMGB1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)D-Gal+LPS诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞HMGBI存在从细胞核向胞浆的移位。(4)LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的移位和释放可能存在CRM1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis Bvirus，HBV)感染。而高迁移率族
23、蛋白l(high mobility group box-1protein，HMGB1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明HMGB1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞HMGB1的移位及释放情况。 目的：(1)研究LPS或TNF-，刺激是否可引起肝细胞HMGB1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞HMGB1移位；(3)研究D-GaIN+LPS诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞HMGB1移位；(4)初步探讨肝细胞HMGB1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度
24、LPS或TNF-刺激肝细胞系HepG2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。MTT法测定细胞存活率，TUNEL法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的LDH含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。Western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中HMGB1的含量，免疫荧光技术观察HMGB1移位。ELISA，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察HMGB1在肝细胞中的分布情况。同时行HE染色，评估肝组织的病理学改变。(3) D-GaIN联合LPS腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水
25、对照组。于D-GalN+LPS注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行HMGB1的免疫组织化学染色。(4)用Western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素B(LMB)和曲古霉素(TSA)对LPS诱导的肝细胞HMGB1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用LPS或TNF-刺激可诱导HepG2细胞释放HMGB1，释放到上清中的HMGB1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到HepG2细胞胞核中的HMGB1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，LPS(400ng/mL)或TNF-(25ng/mL)诱导的HMGB1分泌量随LPS或TNF-剂量增加而增加。MTT，T
26、UNEL检测及上清中LDH含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白Westem blotting分析亦证实了细胞浆中的HMGB1表达增强。ELISA和细胞因子抗体芯片检测表明LPS，TNF-或重组HMGB1刺激HepG2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的HMGB1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞HMGB1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) D-GalN+LPS注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(P<0.0
27、1)。(4)体外CRM1抑制剂LMB可以显著减少LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的释放，及HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可以促进LPS诱导的HMGB1释放，促进HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) LPS或TNF-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的HepG2细胞核蛋白HMGB1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在HMGB1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)D-Gal+LPS诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞HMGBI存在从细胞核向胞浆的移位。(4)LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的移位
28、和释放可能存在CRM1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis Bvirus，HBV)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，HMGB1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明HMGB1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞HMGB1的移位及释放情况。 目的：(1)研究LPS或TNF-，刺激是否可引起肝细胞HMGB1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因
29、子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞HMGB1移位；(3)研究D-GaIN+LPS诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞HMGB1移位；(4)初步探讨肝细胞HMGB1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度LPS或TNF-刺激肝细胞系HepG2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。MTT法测定细胞存活率，TUNEL法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的LDH含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。Western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中HMGB1的含量，免疫荧光技术观察HMGB1移位。ELISA，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重
30、型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察HMGB1在肝细胞中的分布情况。同时行HE染色，评估肝组织的病理学改变。(3) D-GaIN联合LPS腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于D-GalN+LPS注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行HMGB1的免疫组织化学染色。(4)用Western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素B(LMB)和曲古霉素(TSA)对LPS诱导的肝细胞HMGB1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用LPS或TNF-刺激可诱导HepG2细胞释放HMGB1，释放到上清中的HMGB1量随着作用时间延长而增高，20h时达
31、到峰值，免疫荧光观察到HepG2细胞胞核中的HMGB1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，LPS(400ng/mL)或TNF-(25ng/mL)诱导的HMGB1分泌量随LPS或TNF-剂量增加而增加。MTT，TUNEL检测及上清中LDH含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白Westem blotting分析亦证实了细胞浆中的HMGB1表达增强。ELISA和细胞因子抗体芯片检测表明LPS，TNF-或重组HMGB1刺激HepG2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的HMGB1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及
32、正常肝组织中，肝细胞HMGB1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) D-GalN+LPS注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(P<0.01)。(4)体外CRM1抑制剂LMB可以显著减少LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的释放，及HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可以促进LPS诱导的HMGB1释放，促进HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) LPS或TNF-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的HepG2细胞核蛋白HMGB1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在HMGB
33、1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)D-Gal+LPS诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞HMGBI存在从细胞核向胞浆的移位。(4)LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的移位和释放可能存在CRM1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis Bvirus，HBV)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，HMGB1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研
34、究表明HMGB1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞HMGB1的移位及释放情况。 目的：(1)研究LPS或TNF-，刺激是否可引起肝细胞HMGB1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞HMGB1移位；(3)研究D-GaIN+LPS诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞HMGB1移位；(4)初步探讨肝细胞HMGB1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度LPS或TNF-刺激肝细胞系HepG2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。MTT法测定细胞存活率，TUNEL法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的LDH含量，以明确细胞
35、是否凋亡或坏死。Western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中HMGB1的含量，免疫荧光技术观察HMGB1移位。ELISA，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察HMGB1在肝细胞中的分布情况。同时行HE染色，评估肝组织的病理学改变。(3) D-GaIN联合LPS腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于D-GalN+LPS注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行HMGB1的免疫组织化学染色。(4)用Western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素B
36、(LMB)和曲古霉素(TSA)对LPS诱导的肝细胞HMGB1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用LPS或TNF-刺激可诱导HepG2细胞释放HMGB1，释放到上清中的HMGB1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到HepG2细胞胞核中的HMGB1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，LPS(400ng/mL)或TNF-(25ng/mL)诱导的HMGB1分泌量随LPS或TNF-剂量增加而增加。MTT，TUNEL检测及上清中LDH含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白Westem blotting分析亦证实了细胞浆中的HMGB1表达增强。ELISA和细胞因子抗体
37、芯片检测表明LPS，TNF-或重组HMGB1刺激HepG2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的HMGB1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞HMGB1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) D-GalN+LPS注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(P<0.01)。(4)体外CRM1抑制剂LMB可以显著减少LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的释放，及HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可以促进LPS诱
38、导的HMGB1释放，促进HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) LPS或TNF-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的HepG2细胞核蛋白HMGB1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在HMGB1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)D-Gal+LPS诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞HMGBI存在从细胞核向胞浆的移位。(4)LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的移位和释放可能存在CRM1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis
39、 Bvirus，HBV)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，HMGB1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明HMGB1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞HMGB1的移位及释放情况。 目的：(1)研究LPS或TNF-，刺激是否可引起肝细胞HMGB1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞HMGB1移位；(3)研究D-GaIN+LPS诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞HMGB1移位；(4)初步探讨肝细胞HMGB1移位及释
40、放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度LPS或TNF-刺激肝细胞系HepG2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。MTT法测定细胞存活率，TUNEL法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的LDH含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。Western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中HMGB1的含量，免疫荧光技术观察HMGB1移位。ELISA，细胞因子芯片技术检测上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察HMGB1在肝细胞中的分布情况。同时行HE染色，评估肝组织的病理学改变。(3) D-GaIN联合LPS腹腔注射
41、，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于D-GalN+LPS注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行HMGB1的免疫组织化学染色。(4)用Western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素B(LMB)和曲古霉素(TSA)对LPS诱导的肝细胞HMGB1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用LPS或TNF-刺激可诱导HepG2细胞释放HMGB1，释放到上清中的HMGB1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到HepG2细胞胞核中的HMGB1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，LPS(400ng/mL)或TNF-(25ng/mL)诱导的HMGB1分泌量随
42、LPS或TNF-剂量增加而增加。MTT，TUNEL检测及上清中LDH含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白Westem blotting分析亦证实了细胞浆中的HMGB1表达增强。ELISA和细胞因子抗体芯片检测表明LPS，TNF-或重组HMGB1刺激HepG2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的HMGB1的移位，移位率约为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞HMGB1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) D-GalN+LPS注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照
43、组比较，显著为高(P<0.01)。(4)体外CRM1抑制剂LMB可以显著减少LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的释放，及HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可以促进LPS诱导的HMGB1释放，促进HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) LPS或TNF-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的HepG2细胞核蛋白HMGB1的移位及释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在HMGB1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)D-Gal+LPS诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞HMGBI存在从细胞核向胞浆的移位。(4)
44、LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的移位和释放可能存在CRM1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis Bvirus，HBV)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，HMGB1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明HMGB1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞HMGB1的移位及释放情况。 目的：(1)研究LPS或TNF-，刺激是否可引起肝细胞HMGB
45、1的移位及释放，检测是否同时伴有其他细胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝细胞HMGB1移位；(3)研究D-GaIN+LPS诱导的急性肝衰竭小鼠肝细胞HMGB1移位；(4)初步探讨肝细胞HMGB1移位及释放的可能机制。 方法：(1)体外用不同浓度LPS或TNF-刺激肝细胞系HepG2细胞，不同时间点分别收集细胞和培养上清。MTT法测定细胞存活率，TUNEL法检测细胞凋亡率，同时测定培养上清中的LDH含量，以明确细胞是否凋亡或坏死。Western blotting方法检测培养上清，细胞核和细胞浆组分蛋白中HMGB1的含量，免疫荧光技术观察HMGB1移位。ELISA，细胞因子芯片技术检测
46、上清中的细胞因子分泌。(2)分别收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝组织，免疫组织化学染色观察HMGB1在肝细胞中的分布情况。同时行HE染色，评估肝组织的病理学改变。(3) D-GaIN联合LPS腹腔注射，诱导小鼠急性肝衰竭模型，同时设置生理盐水对照组。于D-GalN+LPS注射后3h处死动物，收集肝脏组织，进行HMGB1的免疫组织化学染色。(4)用Western blotting和免疫荧光技术，分别观察来普霉素B(LMB)和曲古霉素(TSA)对LPS诱导的肝细胞HMGB1移位和释放的影响。 结果：(1)体外用LPS或TNF-刺激可诱导HepG2细胞释放HMGB1，释放到上清中的HM
47、GB1量随着作用时间延长而增高，20h时达到峰值，免疫荧光观察到HepG2细胞胞核中的HMGB1发生了向细胞浆的移位。在一定剂量范围内，LPS(400ng/mL)或TNF-(25ng/mL)诱导的HMGB1分泌量随LPS或TNF-剂量增加而增加。MTT，TUNEL检测及上清中LDH含量测定排除了细胞处于凋亡及坏死状态。细胞组分蛋白Westem blotting分析亦证实了细胞浆中的HMGB1表达增强。ELISA和细胞因子抗体芯片检测表明LPS，TNF-或重组HMGB1刺激HepG2细胞24h，仅见个别其他细胞因子的释放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中可观察到明显的HMGB1的移位，移位率约
48、为32.847.13。而在慢性乙型肝炎组及正常肝组织中，肝细胞HMGB1集中分布于细胞核中，未见明显的移位。(3) D-GalN+LPS注射后3h，发生移位的肝细胞百分率为：27.424.99。移位率与生理盐水对照组比较，显著为高(P<0.01)。(4)体外CRM1抑制剂LMB可以显著减少LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的释放，及HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可以促进LPS诱导的HMGB1释放，促进HMGB1从细胞核向细胞浆的移位。 结论：(1) LPS或TNF-a可时间及剂量依赖性诱导体外培养的HepG2细胞核蛋白HMGB1的移位及释放。(2
49、)慢性重型乙型肝炎患者肝细胞中存在HMGB1从细胞核向胞浆的移位，而在慢性乙型肝炎及正常对照肝细胞中并无这种移位现象。(3)D-Gal+LPS诱导的急性肝衰竭模型小鼠肝细胞HMGBI存在从细胞核向胞浆的移位。(4)LPS诱导的HepG2细胞HMGB1的移位和释放可能存在CRM1依赖的核转运，可能与乙酰化相关。肝衰竭是一种病死率很高的临床危重症，在我国肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis Bvirus，HBV)感染。而高迁移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，HMGB1)在细胞外是一种关键的“晚期”促炎症介质，已经成为脓毒症防治研究中一个重要的新靶标。有研究表明HMGB1可能在重型肝炎肝衰竭中发挥重要作用。本研究旨在探讨肝衰竭时肝细胞HMG
