免疫组织化学检验技术.ppt

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1、,免疫学检验,第二十二章 免疫组织化学检验技术,免疫组织化学检验技术又称免疫细胞化学检验技术-是利用标记的特异性抗体（或抗原）与组织细胞内抗原（或抗体）进行的抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对组织和细胞抗原进行定性、定位、定量测定的免疫检测方法。,免疫组化的检测原理,免疫组化的检测原理,免疫组化的检测原理,第一节 免疫组化检验技术基本知识,免疫组化全过程,一、标本制作,标本制作是获得良好的免疫细胞组织化学分析的保障，良好的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确显示和定位。（一）标本的主要来源 主要有：活体组织 各种体液及穿刺液 培养细胞等,（二）标本的固定与保存 1组织材料的固定目的 防止组织细

2、胞的死后变化，以保持其固有形态 使细胞内的蛋白质等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构 使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，以便染色后易于鉴别和观察 固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，便于制片 防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构 经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。,2固定剂的选择 最佳固定剂的标准 最好地保持细胞和组织的形态结构 最大限度地保存抗原的免疫活性 3固定方法 固定方法常用 浸泡法主要适用于活检和手术标本以及其它不能进行灌注的组织固定。灌注法适用于动物实验研究。,（三）玻片的处理 玻片的处理是做好免疫组化染色的重要步骤之一

3、一般用免疫组织化学的载玻片均需涂一定的黏合剂，常用的切片黏合剂有树脂胶、多聚赖氨酸和防脱片剂（四）切片方法的选择,二、抗原处理,（一）进行抗原的暴露和修复的原因 1.固定液的影响 2.抗体制备的影响（二）抗原的暴露 主要采用酶消化的方法 在选择酶消化时，应针对要显示的不同的抗原成分而选用不同的酶 在日常工作中用胰蛋白酶消化即可,（三）热诱导的抗原修复 抗原修复是以高温、高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复以提高抗原抗体的阳性检出率 微波处理法水浴锅法压力锅法,三、抗体处理,抗体是免疫组织化学技术的首要试剂（一）抗体的选择 具有高度特异性和稳定性的优质抗体（二）抗体的稀释 抗原抗体反应须有适当的比

4、例，过量或不足均不能达到预期结果（三）抗体的合理保存 要特别注意保持抗体的生物活性,四、常用标记物,（一）荧光素 如：异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明等（二）酶 如：辣根过氧化物酶(HRP)（三）生物素-亲和素系统（四）免疫金标记技术（五）免疫铁蛋白技术,五、免疫组织化学技术的结果判断,（一）对照染色设计 为了保证免疫组织化学染色的准确性，证明和肯定阳性结果的特异性，排除某些非特异性染色，通常需针对第一抗体设立对照。1.阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫组织化学染色。目的是证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。2.阴性对照 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结

5、果，称阴性对照。目的是排除假阳性。,3.阴性试剂对照 是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂（尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性）而设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、替代对照、吸收试验和抑制试验等。4.自身对照 是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。,（二）阳性结果阳性细胞的显色可位于细胞膜、细胞质和细胞核 免疫显色强度和阳性细胞密度是定性、定量指标 阳性细胞的着色形态（如胞膜型、胞核型、胞质(浆)型等）及组织分布特点（如局灶型、弥漫型、片块型等）主要是定位指标哪怕只有少数细胞阳性（只要是抗原所在部位）也应视为阳性表达,（三）阴性结果 阴性结果不能简单视为抗原不表达，由于染

6、色方法灵敏度有高低之分，有时可因灵敏度不够，而导致阴性反应。（四）特异性显色和非特异性显色的鉴别 1.分布位置 特异性反应必须分布于特定抗原部位 非特异性反应无一定的分布规律,2.显色强度 特异性反应由于细胞内抗原含量不同，显色强度不一。阳性细胞的染色常定位于细胞，并与阴性细胞间有明显间隔 而非特异性染色常不限于单个细胞，常为成片的细胞 3.其他 在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色,六、质量控制,质量控制是免疫组织化学检验技术取得满意结果的必要条件。（一）试剂质量控制 抗体的质量是免疫组织化学染色成功的关键（二）操作过程质量控制 实验操作 标本的质量控制（三）仪器设备和器具的质量

7、控制,第二节 酶免组织化学检验技术,酶免组织化学检验技术是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，然后加入酶的底物，催化底物显色，借助光镜或电镜，就可识别出标本中抗原（抗体）的分布和性质；也可通过图像分析技术达到定量的目的。,一、标本制作,常用的标本有组织切片、组织印片和细胞涂片 酶免组织化学检验技术可分为 酶标记抗体免疫组织化学染色法 非标记抗体酶免疫组织化学染色法,二、酶标记抗体的免疫组化染色法,（一）原理 酶标记抗体的免疫组织化学染色法是借助交联剂的共价键作用将酶直接连接在抗体（或抗抗体）上，酶标抗体（或抗抗体）与组织内特异抗原或抗原抗体复合物反应后，

8、通过酶对底物的催化作用，生成不溶性有色产物并沉淀在特定位置，达到对抗原定性、定位、定量检测的目的。,（二）技术类型 1.直接法 形成抗原一抗体一酶复合物2.间接法 形成Ag-Ab1-Ab2E复合物3.酶标抗体三步染色法 为间接法的改良法 形成Ag-Ab1-Ab2E-Ab3E复合物（三）方法评价,三、非标记抗体酶免疫组化染色法,（一）原理 该技术首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体（Ab3），将酶与Ab3结合形成复合物，然后利用第二抗体（Ab2）作桥，Ab2既可与 Ab3的Fc段结合，又可与结合在组织抗原上的第一抗体（Ab1）的Fc段结合，经酶催化底物的显色反应，达到对抗原的检测。,

9、（二）技术类型1.酶桥法 用辣根过氧化物酶（HRP）免疫动物（如兔）制备抗HRP的抗体（Ab3），经Ab2（如羊抗兔）作桥，将结合在组织抗原上的Ab1(兔抗相应组织抗原的抗体)与Ab3连接起来，最后将HRP与Ab3结合形成Ag-Ab1-Ab2-Ab3-HRP复合物，加底物显色,2.PAP法 即过氧化物酶（P）-抗过氧化物酶（AP）法，为酶桥法的改良，技术要点基本上与酶桥法相同，但该法将抗酶抗体（抗过氧化物酶（AP）与酶（过氧化物酶（P）制成了可溶性复合物（PAP）,该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形，非常稳定。通过桥抗体（Ab2）将特异性识别组织抗原的抗体（Ab1）与PA

10、P复合物的抗酶抗体连接起来,3.双桥PAP法 该法是PAP法的改良，通过两次连接桥抗体和PAP，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了比PAP法更多的酶分子，大大增强了方法的敏感性。4.APAAP法 APAAP法就是以碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶（AP）-抗碱性磷酸酶（AAP）法，简称APAAP法。技术要点与PAP法相似。,（三）方法评价 该技术既可检测抗原，又可检测抗体。由于酶不是标记在抗体上，而是经抗原（酶）抗体反应与抗酶抗体结合，避免了酶标抗体的缺点，提高了方法的敏感性。尤其是双桥PAP法，是当今免疫组化技术中敏感性较高的方法。,四、临床

11、应用,酶免疫组织化学检验技术主要用于组织切片或其它抗原的定性、定位、定量检测。组织切片中各类抗原性物质，如各类蛋白质、酶、激素、细胞、病毒、肿瘤抗原、浆细胞中的免疫球蛋白、各种多肽、细胞表面标志等均可检测。,第三节 荧光免疫组织化学检验技术,利用抗原抗体特异性结合的原理，先用荧光素标记已知抗体并以此作为探针，检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后，即会发出一定波长的荧光，进而对组织中的某种抗原进行定性、定位和定量分析。,一、标本制作,常见的临床标本材料主要有组织、细胞和细菌三大类，按不同标本性质可制作涂片、印片或组织切片等。（一）载玻片和盖玻

12、片的处理 载玻片和盖玻片要厚薄均匀、洁净及透光性好,（二）制片 1组织切片 组织材料可制备成冰冻切片或石蜡切片。2印片 组织材料也可制成印片。3涂片 细胞或细菌要制成涂片，涂片应薄且均匀。,（三）标本的固定 主要目的是：1.防止细胞或切片从玻片上脱落 2.去除妨碍抗原抗体结合的类脂 3.便于保存。除活细胞外，其他标本应在染色前以适当的方式固定。（四）标本片的保存 固定好的标本片应尽快荧光染色检查，如需保存，置-20下低温干燥保存。,二、荧光抗体标记及染色,荧光抗体是荧光免疫技术的关键试剂，是将荧光素与特异性抗体通过共价键的方式结合而成。其制备过程通常包括抗体的标记、纯化和鉴定三步。在已固定的标

13、本上滴加经适当稀释的荧光抗体，置于带盖的湿盒内，37温育30min。检测不耐热抗原以4过夜为宜。温育后充分洗涤、干燥、镜检。,三、临床应用,1.在自身免疫性疾病中的应用 2.各种病原微生物的快速检查和鉴定 3.寄生虫感染的诊断 4.白细胞分化抗原的检测 此外还应用于HLA、肿瘤组织中的肿瘤抗原、组织中的免疫球蛋白和补体组分、激素和酶的定位等。,第四节 亲和组织化学检验技术,亲和组织化学是利用两种物质之间的高度亲和力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如生物素、葡萄球菌A蛋白、植物血凝素等，对某种组织成分具有高度亲和力，可与蛋白质、糖类、荧光素和酶等多种类型的大小分子结合形成相应复合

14、物，采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应等技术，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位、定性或定量分析。用于亲和组织化学的物质有生物素与亲和素、植物凝集素与糖类、SPA与IgG、链霉亲和素与生物素等。,一、生物素-亲和素法,生物素可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素也称抗生物素，每个亲和素分子有生物素结合的4个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合物。,常用的技术类型有：1.标记亲和素-生物素法（LAB法）将亲和素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通

15、过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲和素结合在抗体的生物素上，如此多层放大，提高了检测抗原的敏感性。,2.桥连亲和素-生物素法（BAB法）先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲和素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。,3.亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物法（ABC法）此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲和素与酶（辣根过氧化物酶）标生物素结合在一起，形成亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC复合物），当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC中未饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，最终形成晶格样

16、结构的复合体，其中网络了大量酶分子，加底物显色，可大大提高检测抗原的灵敏度。,二、SPA法,SPA具有和人及许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴等的IgG Fc结合的能力，这种结合不会影响抗体的活性。每个SPA分子可同时结合两个IgG分子，也可一方面同IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。,三、链霉亲和素生物素技术,链霉亲和素与生物素的结合是已知自然界中最强的非共价相互作用之一，其功能类似亲和素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲和素蛋白就组成酶标链霉亲和素-生物素方法（LSAB）。LSAB法的特点:特异性强；分子量小，穿透力强，放大效应远超ABC法，故其敏感性更

17、强；等电点中性更适合组织，可明显减少非特异性染色，低背景着色使特异性着色更清晰；操作时间缩短，更简便。,四、凝集素法,一种凝集素具有专一性结合某种特异性糖基的能力，同时所有生物膜都含有一定量的糖类，后者主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。因此，凝集素可作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜或电镜水平显示其结合部位。,一般认为细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型并反映细胞在分化、成熟和细胞病变中的变化。标记了相应示踪物的凝集素可用来：作为细胞分化和成熟的标记 作为细胞特殊类型的标记 肿瘤细胞伴有细胞膜的改

18、变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，也可用凝集素检测出肿瘤细胞。,常用下列染色法：直接法标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合 间接法将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将标记物结合在抗凝集素抗体上 糖凝集素糖法 本法是利用过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合，经冲洗后，凝集素上还存在未被占用的结合部位，未结合部位与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个“三明治样”的糖凝集素糖的结合物。,第五节 其他免疫组织化学检验技术,一、金免疫组织化学技术 免疫胶体金技术是以胶体金作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性没有明

19、显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如SPA)等作为探针，能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位或定量研究。,（一）免疫金（银）光镜染色技术 基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子(Ag)还原成银原子(Ag)，被还原的银原子围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成，本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”不断变大，最终使抗原位置得到更清楚的放大，在光镜下就可观察到被放大的抗原位置呈现黑色或黑褐色。,（二）免疫金电镜染色技术 胶体金与镍网上待检标本的相应蛋白质发生结合，由于胶体金具有高电子密度，故金标蛋白结合处，电镜下可见黑褐色颗粒，从而可对细胞膜上或细胞内的蛋白质进行定性与定位分析。,二、酶标记免疫电镜技术 酶标记免疫电镜技术是用酶标抗体与组织或细胞抗原发生特异性结合后，加酶底物显色，在电镜下观察显色反应的强度。它是将电镜的高分辨力与酶免疫技术的特异性结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定性分析的一种高度精确、灵敏的方法。,三、免疫胶体铁细胞组织化学技术 胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小和电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原（抗体）的定位研究。,