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1、第五讲基因工程的载体,Vectors for Gene Engineering,In molecular biology,a vector is a DNA molecule used as a vehicle to transfer foreign genetic material into another cell.,载体（vector）是可以携带外源核酸进入宿主细胞，并能进行独立和稳定自我复制或表达的核酸分子。,Common to all engineered vectors are an origin of replication,a multicloning site,and a s
2、electable marker.,The vector itself is generally a DNA sequence that consists of an insert(transgene)and a larger sequence that serves as the backbone of the vector.The purpose of a vector which transfers genetic information to another cell is typically to isolate,multiply,or express the insert in t
3、he target cell.,Vectors called expression vectors(expression constructs)specifically are for the expression of the transgene in the target cell,and generally have a promoter sequence that drives expression of the transgene.Simpler vectors are only capable of being replicated but not translated:they
4、can be replicated in a target cell but not expressed,unlike expression vectors.Simpler vectors are used to amplify their insert.,1、分子较小，可携带比较大的片段。2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。3、尽可能有多种限制酶切位点，但每一种限制酶又要有最少的切割位点。4、有适合的标记，易于筛选。5、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制。6、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。,作为基
5、因工程的载体，一般应具备以下性能：,The four major types of vectors are plasmids,bacteriophages and other viruses,cosmids(粘粒),and artificial chromosomes.,原核生物的克隆载体真核生物的克隆载体 酵母及其他真菌的克隆载体 高等植物的克隆载体 昆虫的克隆载体 哺乳动物的克隆载体,质粒(Plasmid)噬菌体(Bacteriophage)染色体,一、原核生物的克隆载体,1 质粒(plasmid),1.1 质粒的基本性质(basic features),质粒是细胞中染色体外的一种能自我复
6、制的环状双链DNA分子。,A circular,double-stranded unit of DNA that replicates within a cell independently of the chromosomal DNA.Plasmids are most often found in bacteria and are used in recombinant DNA research to transfer genes between cells.,质粒不能利用染色体上的复制起点，因此，所有的质粒都至少含有一段可作为复制起点（origin of replication）的DNA
7、序列，也就是说质粒能够在细胞内独立于宿主细胞本身的复制周期而实现扩增。小一些的质粒可以利用宿主细胞本身的DNA聚合酶来进行自我复制，而大一些的质粒本身携带有能够编码自身质粒复制所需的专一性酶的基因。,还有一小类质粒还能够将自己插入到宿主细胞染色体中进行复制。这些质粒可以以整合形式稳定存在于细胞中很多代，但也会在某些阶段以独立的成分存在。具有这种性质的质粒又叫整合型质粒、游离型质粒或附加体（episome）。,质粒DNA的构型：SC型 共价闭合环形DNA（covalently closed circuar DNA，cccDNA）OC型 开环DNA（ocDNA）L 型 线性DNA（LDNA）,OC
8、型,SC型,L 型,不同构型DNA的移动速度次序为：SC DNAL DNA OC DNA,1.2 质粒的大小和拷贝数(size and copy number),质粒的大小和拷贝数对于基因克隆来说尤为重要。质粒的大小范围从1.0到250 Kb不等，其中只有很小的一部分能够在克隆实验中得到应用。拷贝数指的是在通常情况下，一个细菌细胞中某种质粒的分子数。现在还不清楚控制拷贝数的因素。一般来说，一个作为克隆载体的质粒需要在细胞中以多拷贝的形式存在，这样才能够获得大量的重组DNA分子。,1.3 质粒的接合性和相容性(conjugation and compatibility),质粒可以分为两大类：结合
9、性质粒（conjugative plasmid)和非结合性质粒(non-conjugative plasmid)。接合性质粒除了自主复制所必须的基因以外，还有一套能够促进细菌细胞间的有性结合和质粒转移的基因。这些转移基因存在于接合性质粒中，而在非接合性质粒中不存在。,接合性质粒从一个细胞向其他细胞进行扩散的过程,在同一个细胞中能够发现不同种类的质粒，比如大肠杆菌细胞中可同时含有多达7种不同的质粒，这些不同的质粒为了能够共存于同一细胞中，必需能够相容（compatible）。如果两个质粒不能够相互适应，不具备相容性，在没有选择压力的情况下，其中一个将很快从细胞中消失。因此，根据不同质粒间是否具备
10、相容性，可以把它们划分成不同的不相容群体（incompatibility group）。质粒不相容性:同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性(不亲和性)。,1.4 质粒的种类,（1）致育质粒或称F质粒（fertility plasmid）：是第一个从大肠杆菌细胞中被发现的质粒，携带有负责接合转移的基因（tra genes）即编码形成性纤毛的基因和DNA复制的基因。是 E.coli 等细菌中决定性别的质粒。它是一个分子量为62106 Da、94.5kb、约等于2%核染色体DNA的小型cccDNA。它能编码约94个中等大小的多肽，而其中有 1/3 的基
11、因（tra区）与接合作用（conjugation）有关。,根据质粒的主要特征可以把质粒分为以下5类：,oriT,oriV,tra genes32 kb,100 kb,used to initiate replication for transfer,used to initiate plasmid replication,IS elements(insertion sequences used in transposition),Discrete region that has transfer genes:tra&trb loci(40 genes),(Origin of transfer)
12、,F plasmid,（2）耐药性质粒或称R质粒(Resistance-(R)plasmids)：又称R因子，携带有能赋予宿主细菌对某一种或多种抗生素抗性的基因，如抗氯霉素、氨苄青霉素。R因子在细胞内的拷贝数可从 12 个到几十个，分属严紧型和松弛型复制控制。后者经氯霉素处理后，拷贝数甚至可达到 2 0003 000 个。,多数R因子是由相连的2个DNA片段组成。其一称RTF 质粒（resistance transfer factor，抗性转移因子），它含有调节 DNA 复制和拷贝数的基因及转移基因。RTF 的分子量为11106 Da。其二为抗性决定质粒（r-determinant），大小不很
13、固定。其上含有其他抗生素的抗性基因，例如抗青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。,RTFConjugative plasmidTransfer genesR determinantResistance genesTransposons,（3）Col质粒（Col plasmids），又称大肠杆菌素质粒，赋于大肠杆菌产生大肠杆菌素（colicins）的能力，具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其他肠道细菌的功能，其分子量约4104 8104Da。Col 因子可分两类，分别以ColEl和ColIb 为代表。前者分子量小，无接合作用，是多拷贝的；后者分子量较大，它与F因子相似，
14、具有通过接合作用转移的功能，属严紧型控制，只有 12个拷贝。凡带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。,（4）降解质粒（degradative plasmids)携带有分解或降解某种芳香族化合物为简单化合物或无机物的酶系基因的质粒，赋予宿主细胞降解某种芳香族化合物的能力。降解性质粒只在假单胞菌属（Pseudomonas）中发现。这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解 CAM（樟脑）、OCT（辛烷）、XYL（二甲苯）、SAL（水杨酸）、MDL（扁桃酸）、NAP（萘）和TOL（甲苯）质粒等。,（5）毒性质粒（virulence plasmids）
15、赋予宿主菌致病性，比如根瘤农杆菌中的Ti质粒，能够在双子叶植物中诱导根瘤菌。,即诱癌质粒，存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物的根癌。当细菌侵入植物细胞中后，把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物的遗传性，达到培育植物优良品种
16、的目的。,Ti质粒（tumor inducing plasmid）,1.5 细菌外其他生物体中的质粒,尽管质粒在细菌中广泛存在，但在其他生物体中却并不常见。人们在酿酒酵母菌株中观察到了2 m质粒（2m circle）。2 m质粒的发现是非常幸运的，因为人们可以利用2 m质粒构建载体来转化酵母这种非常重要的生物。,2.1 质粒克隆载体的命名法,质粒命名第1个小写字母P表示质粒(plasmid)，后面2个或3个大写字母表示构建该质粒的研究人员的姓名或实验室名称，最后的数字表示构建的一系列质粒的编号。pBR:B&R,Bolivar and Rodriguez(pBR322)pUC:UC,Univer
17、sity of California(pUC18/19)pCR:clever name for a vector used to clone PCR products,2.质粒克隆载体,天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有ColE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。,2.2天然质粒,第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含有一个EcoRI酶切位点，一个四环素抗性选择记号（Tetr），插入外源片断后不影响其复制功能，但该质粒分子量较大(9263bp)，拷贝数低。,Stanley N.Cohen科恩,The
18、 SC stands for Stanley Cohen,2.3.1 pBR322质粒,pBR322 is a plasmid and for a time was one of the most commonly used E.coli cloning vectors.pBR322 was the first artificial plasmid.Created in 1977,it was named eponymously after its Mexican creators,p standing for plasmid,and BR for Bolivar and Rodriguez.
19、,2.3 几种常见的质粒克隆载体,4361bp,pBR322 is 4361 base pairs in length and contains a replicon region(source plasmid pMB1),the ampR gene,encoding the ampicillin resistance protein(source plasmid pSE2124)and the tetR gene,encoding the tetracycline resistance protein(source plasmid pSC101).The plasmid has unique
20、 restriction sites for more than forty restriction enzymes.13 of these 40 sites lie within the tetR gene.There are 6 key restriction sites inside the ampR gene.The origin of replication or ori site in this plasmid is pMB1(a close relative of ColE1).,第一部分来源于pSE2124的氨苄青霉素抗性基因（Apr）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗
21、性基因（Tcr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒PMB1的DNA复制起点（ori）,pBR322的第一个优点在于它的大小。作为一个克隆载体，它应该小于10 Kb，否则在提纯的时候很容易导致DNA断裂。pBR322本身只有4361 bp，这就意味着我们很容易纯化它以及由它构建的重组体。即便添加上6 Kb的DNA片段，pBR322的大小仍在可操作的范围内。,pBR322的第二个优点是它有两个抗生素抗性基因。这两个抗药性基因都可以作为该质粒的筛选标志，而且每个抗性基因都拥有几个单酶切位点，这在克隆实验中特别有用。用Pst I,Puv I或Sca I酶切后插入DNA会导致氨苄青霉素抗性基因失活，
22、用BamH I和SalI等限制性内切核酸酶酶切后插入DNA会导致四环素抗性基因失活。有大量的限制性酶切位点可以用作插入失活，这意味着pBR322支持很多种不同的酶切片段的插入。,第三个优点在于pBR322有相当多的拷贝数。通常在被转化过的大肠杆菌中有大约15个pBR322质粒分子，而且在蛋白质合成抑制剂(氯霉素)存在的情况下，通过质粒扩增，pBR322的拷贝数可以增加到10003000。这样，通过培养大肠杆菌就可以获得大量重组pBR322质粒分子。,2.3.2 pBR327-一个高拷贝数质粒,pBR327通过从pBR322中移去一个长1 089 bp的片段而构建。该片段的删除并没有损伤ampR
23、和tetR这两个抗性基因，但改变了质粒的复制能力和结合能力。因此，pBR327与pBR322有两点重要不同。（1）pBR327的拷贝数比pBR322更高，这表现在每个大肠杆菌细胞可以存在3045个质粒分子。（2）1 089 bp片段的删除，破坏了pBR322的结合能力，使它不能通过结合转移到另一个大肠杆菌细胞中去。这一点对生物防范很重要。,2516,1427,pUC也是一个来自于pBR322的质粒，它保留了后者的复制起点和ampR基因。但是，ampR基因的核苷酸序列被改变了，不再包含一些限制性单酶切位点。而所有这些位点被集中到pUC所携带的lacZ基因上的一小段序列上。pUC是一个系列，包括p
24、UC8、pUC9、pUC18、pUC19，8与9表示MCS是正向和反向，其编号与MCS中限制位点数目有关，编号愈大，MCS中含有的限制位点数愈多。,2.3.3 pUC-a Lac selection plasmid,pUC8所拥有的3个优点使它成为最受欢迎的大肠杆菌克隆载体之一。第一个优点的获得纯属偶然，人们在构建这个质粒时，在它的复制起点上产生了一个偶然的突变，使它在大肠杆菌中的拷贝数达到了500700，这还是它在扩增以前的数目。这样我们就可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量的目的DNA。,第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅需要把待筛选的大肠杆菌细胞铺到含有氨苄青霉素和X-gal的琼脂
25、培养基上。无论是pBR322还是pBR327，重组体的筛选都需要把菌落从一种抗生素培养基平移到另一种抗生素培养基上。一个用pUC8作载体的克隆实验比选择pBR322和pBR327要节约一半的时间。,第三个优点是pUC8具有众多的单酶切位点，这使有两个不同粘性末端的DNA片段可以直接被克隆。,Blue/White Color Screening,lacZ,functional enzyme,-半乳糖苷酶基因（lacZ）,X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的显色底物，在-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。,异丙基硫-D-代半乳糖苷,2
26、.3.4 pGEM3Z克隆DNA的体外转录,pGEM3Z与pUC8载体很相似：都含有ampR和lacZ基因，lacZ中有一个多酶切位点，两个质粒的大小也十分相似。它们之间的区别在于，pGEM3Z多了两个短片段，每个片段都含有一个启动子序列，募集RNA聚合酶。外源DNA在限制性酶切位点插入pGEM3Z载体，在限制性酶切位点的两边就分别存在着两个启动子序列。,在体外被克隆的DNA分子就可以指导RNA的合成，产生的RNA可用作杂交的探针，也可用于蛋白质的合成，或用于RNA的加工过程。,被pGEM3Z和其他同类载体所携带的启动子并不是大肠杆菌RNA聚合酶识别的标准启动子。它们或被T7噬菌体编码的RNA
27、聚合酶专一性识别，或被SP6噬菌体编码的RNA聚合酶专一性识别。之所以在体外转录系统中选择噬菌体的RNA聚合酶，因为噬菌体的RNA聚合酶的活性要比大肠杆菌的RNA聚合酶的活性高的多，能够每分钟合成12g RNA。,2.4穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）,A shuttle vector is a vector(usually a plasmid)constructed so that it can propagate in two different host species.Therefore,DNA inserted into a shuttle vector
28、can be tested or manipulated in two different cell types.The main advantage of these vectors is they can be manipulated in E.coli and then used in a system which is more difficult or slower to use(e.g.yeast,other bacteria).,穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。,Shuttle vectors inclu
29、de plasmids that can propagate in eukaryotes and prokaryotes(eg.both Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli)or in different species of bacteria(eg.both E.coli and Rhodococcus erythropolis).There are also adenovirus shuttle vectors,which can propagate in E.coli and mammals.,One of the most com
30、mon types of shuttle vectors is the yeast shuttle vector.Almost all commonly used S.cerevisiae vectors are shuttle vectors.Yeast shuttle vectors have components that allow for replication and selection in both E.coli cells and yeast cells.,The E.coli component of a yeast shuttle vector includes an origin of replication and a selectable marker,e.g.antibiotic resistance,Beta lactamase.The yeast component of a yeast shuttle vector includes an autonomously replicating sequence(ARS),a yeast centromere(CEN),and a yeast selectable marker(eg.URA3,a gene that encodes an enzyme for uracil synthesis).,
