第二章基因工程的载体和工具酶课件.pptx

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1、第二章 基因工程的载体和工具酶,第一节 载 体,载体必须是复制子。,基因克隆的目的是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现,作为基因克隆的载体必须具备以下特性,具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。,具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。,自身分子量较小，拷贝数高。,在宿主细胞内稳定性高。,（一）质粒载体的生物学特性（二）质粒载体的制备（三）质粒载体的改造（四）几个常用质粒载体,一 质粒载体（plasimid vectors）,（1）质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的

2、双链环状(少数为线形和RNA）DNA分子。,（一）质粒的生物学特性,（一）质粒的生物学特性,（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大 小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。,（3）质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主 它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠 杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。,（一）质粒的生物学特性,（4）质粒的复制类型,（5）质粒的不亲和性,根据拷贝数将质粒分为两种复制型：,“严紧型”质粒（stigent plasmid），拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid），拷贝数为10-60。,不过

3、即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。,两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。,一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。,接合型质粒分子量大严紧型复制,非接合型质粒分子量小松弛型复制,是否含有接合转移基因,非转移性质粒，不含tra基因；可以为转移性质粒所带动转移。,转移性质粒，含有tra基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。,在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相关性。现归纳如下：,（一）质粒的生物学特性,质粒的转移,（7）质粒的存在形式有超螺旋、开环双

4、螺旋和线状双螺旋三种,（一）质粒的生物学特性,（二）质粒DNA的制备,目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。,分离质粒的方法有多种，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。,碱变性法质粒提取的原理,通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。,在pH值12.012.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。,碱裂解法提取质粒,1 挑取LB固体培

5、养基上生长的单菌落，接种于3.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37、250rpm振荡培养过夜（约16-17hr）。,2 取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心12000rpm，1min，弃上清,3 将细菌沉淀重悬于100l预冷的溶液中，重悬，使菌体分 散混匀,4 加200l新鲜配制的溶液，颠倒数次混匀（不要剧烈振 荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液 为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）,5 加入150l预冷的溶液，将管温和颠倒数次混匀，见白色 絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。,加入450l的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4离心 12000g 10min,

6、7 小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的 无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4离心12000g15min,8 1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4离心8000g10min，弃上清，将沉淀在室温下晾干,9 沉淀溶于20l TE（含RNase A 20g/ml），37水浴 30min以降解RNA分子，-20保存备用。,溶液 I,50 mM葡萄糖/25 mM Tris-HCl/10 mM EDTA，pH 8.0,Tris-HCl控制溶液的pH,葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，因此如果缺了葡萄糖几乎没有影响；,EDTA螯合是Ca2+和Mg2+等二价金属离子

7、，高达10 mM 的EDTA就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，如果不加EDTA也不用怕DNA会迅速被降解,溶液II,0.2 N NaOH/1%SDS,用新鲜的0.4 N的NaOH和2的SDS等体积混合后使用；新鲜的0.4 N的NaOH是保证NaOH溶液没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性，因为破裂细胞的主要是碱，而不是SDS；,这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂，基因组DNA的断裂会带来麻烦,在pH值介于12.0-12.5这个

8、狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解旋变性。共价闭合环状质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，紧密地结合在一起,溶液III,3 M 醋酸钾/2 M 醋酸（pH4.8）,加入后就会有大量的沉淀，是因为SDS遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate,PDS），PDS是水不溶的，因此发生了沉淀；高浓度的盐(3 M醋酸钾)，使得沉淀更完全；溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点,2M的醋酸是为了中和NaOH，调pH值至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因而复性迅速而准确；而线性染色体DNA的两条互

9、补链因彼此已完全分开，复性缓慢且错误率高，缠绕形成网状结构平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀将绝大部分蛋白质沉淀了；,尽管SDS并不与DNA分子结合，由于染色体DNA太长且缠绕形成网状结构，大肠杆菌的基因组DNA也同时被共沉淀,另外长时间的碱性条件会打断DNA，基因组DNA一旦发生断裂成50100 kb大小的片断，就不会被PDS共沉淀；所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,25/24/1的苯酚/氯仿/异戊醇,苯酚用来变性蛋白质,但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑

10、到上层，不利于含质粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收,酚与水有很大的互溶性，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应）；用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净,异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收,2.5倍体积预冷的无水乙醇,与含有质粒的水相混匀，室温放置2-5min，4离心12000g15min,水相含有足够多的盐，只要2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀,如果放到20，时间一长反而会导致大量盐的沉淀,如果感觉发生了盐的沉淀，就用70的乙

11、醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，或者4离心8000g7min，并用tip将沉淀打碎,TE缓冲液含RNase（50 ug/ml）,37水浴30min以降解RNA分子，-20保存备用，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果,碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）如果不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断有时候抽提到的质粒会有710条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致,琼脂糖

12、电泳鉴定质粒DNA,颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快线性DNA分子比开环DNA分子快线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比,改造或增加基因表达的调控序列。,（三）质粒载体的改造,去掉不必要的DNA区段。,减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的 限制性酶切位点）。,加入易于捡出的选择性标记基因。,对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便转移。,（四）几个常用质粒载体,1.质粒pBR322,pBR3224363,（1）氨苄青霉素抗性基因（ampr或Apr）含3种限制酶 单一识别位点。（2）四环素抗性基因（tetr或Tc

13、r）内部有7种，启动区内有2种限制酶单一识别位点。（3）DNA复制起点（ori）,结构特点,pBR3224363,（4）对多种常见的限制性内切 核酸酶只含有一个能切割的 位点,pBR322质粒的结构特点,（1）具有较小的分子量。4363bp，2.6106Da,（2）具有两种抗菌素抗性基因可 供作转化子的选择记号,（3）具较高的拷贝数，而且经 过氯霉素扩增之后,每个细 胞中可累积10003000个 拷贝,外源DNA,pBR3224363,PstI酶切,PstI酶切,黏性末端,黏性末端,连接酶,重组子(ampstetr)空载体(amprtetr)插入子(ampstets),野生型的E.coli(a

14、mpstets),导入,涂布在含Tc的平板上,重组子转化子(ampstetr)空载体转化子(amprtetr),影印在含Ap的平板上,空载体转化子(amprtetr),对比两个平板上的菌落，凡在Tc平板上生长而在Ap平板上不能生长的菌落则是重组质粒转化子克隆，挑选阳性克隆，分离出重组质粒。,2.pUC质粒载体,1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的,结构特点,（4）MCS区段:是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。,（1）来自于pBR322的Ori,（2）

15、氨苄青霉素的抗性基因（ampr)。但核苷酸序列发生了变化,（3）LacZ基因：编码半乳 糖酶的肽链即氨基末端。,2.pUC质粒载体,与pBR322相比，pUC质粒载体优点：,（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数,如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500700个拷贝,（2）适用于组织化学法检测重组体,通过-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子,（3）具有多克隆位点区段（MCS）,可以定向克隆防止载体自我连接,-互补(alpha-complementation),大肠杆菌-半乳糖苷酶 可以和其底物X-Gal 相互作用并且释放出一种蓝

16、色物质，当该酶的-片段和-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶-片段的LacZ 基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的片段。这样一来，含有功能性完整的LacZ 基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的-片段就能和寄主编码的片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被成为是 alpha-complementation.,X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷,释放出的蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色，非常容易辨别，如果 LacZ插入外源基因被破坏，菌落则是无色的。,X-Gal,-半乳糖苷

17、酶,IPTG诱导物,异丙基-D-硫代半乳糖苷,半乳糖,5-溴-4-氯-靛蓝,检测重组体,第二节 基因操作的工具酶,一 限制性核酸内切酶及其应用二 DNA连接酶及其应用三 DNA聚合酶及其应用四 修饰性工具酶,（一）限制性核酸内切酶的发现（二）限制性核酸内切酶的分类（三）限制性核酸内切酶的命名（四）II型限制性核酸内切酶的基本特性（五）限制性核酸内切酶的消化反应,一 限制性核酸内切酶及其应用,由寄主控制的限制和修饰现象-20世纪60年代，Linn和Arber 发现,(K),大肠杆菌B,大肠杆菌K,1,1,410 4,10 4,E.O.P 成斑率efficiency of plating,外源DN

18、A,自身DNA,（一）核酸限制性核酸内切酶的发现,E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶,当(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。,限制修饰的酶学系统,酶切位点不被修饰,噬菌体DNA被切割,酶切位点被修饰,基因组DNA不被切割,最早分离出的限制内切酶1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K菌株，EcoB和EcoK，是

19、I型的，没有实用价值。,首个II型限制内切酶1970年，H.O.Smith等从Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。,从此，相关研究展开。如NEB公司的提取和克隆。目前已纯化出3000种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的。,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5磷酸二酯键。,（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性,（三）限制性核酸内切酶的命名,1、寄主菌属名的第一个字母和种名的

20、头两个字母组成3个斜体 字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco,流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为 Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则 用罗马数字标出，比如Eco R I、Hind III。,（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点,1、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的DNA识别 位点，通常是由48个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。,2、识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称 的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。,3、切

21、割位点的规范性 交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。,几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点,与II型核酸内切酶有关的几个概念,注 意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。,粘性末端 cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。,平 末 端 Blunt end在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。,同裂酶 isoschizomers 能识别和切割同样的核

22、苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。,同尾酶 isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamH I、BclI、BglII和Xho I 是一组同尾酶。,平齐末端,带5P端的黏性末端,带3OH 和5P端的平末端,例如Hpa和Msp是同裂酶，识别顺序都是 5C|CGG3 3GGC|C5 如果其中有5-甲基胞嘧啶，Hpa不能够切割，MspI能切割。,经同尾酶消化的DNA末端连接示意图,5 XXXXGGATCCXXXXXX 33 XXXXCCTAGGXXXXXX 5,BamH I,5 XXXXG GATCCXXXXXX 3

23、 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 5,5 XXXXAGATCTXXXXXX 33 XXXXTCTAGAXXXXXX 5,Bgl II,5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 5,一个限制酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，1h内中完全降解1 g DNA所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：DNA的纯度 DNA的甲基化程度酶切反应的温度（通常为37）DNA的分子结构 核酸内切限制酶的缓冲液 在“非最适的”反应条件下,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它

24、位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用*表示。,（五）限制性核酸内切酶的消化反应,酶 切 反 应 的 基 本 步 骤,电泳,紫外分析,37 1h,加反应液,CK,M,Buffer(10X)2.0 LddH2O 约16.5 LDNA 0.21.0 gEnzyme 12UVolume 20.0 L,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,（一）DNA连接酶的发现（二）DNA连接酶作用特点（三）DNA连接酶的反应条件（四）DNA连接的策略,二 DNA连接酶及其应用,（一）DNA连接酶的发现,环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种 切口的酶存在。

25、首个DNA连接酶(ligase)1967年，大肠杆菌DNA连接酶，是大肠杆菌基因编码。1970年，发现了T4DNA连接酶，由大肠杆菌T4噬菌体基因编码的。,（二）DNA连接酶作用的特点,连接的两条链必须分别具有自由3OH和5P，而且这两 个基团彼此相邻；B.在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程。,E.coli DNA连接酶 连接具互补碱基黏性末端(最初研究表明），现在研究可连接平末端；需NAD+辅助因子，活性低，不常用。T4DNA连接酶连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。,是两条链因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。OH P 是相邻的因此不能封闭g

26、ap，只能封闭nick.,gap NO,Nick OK,（三）T4DNA连接酶连接反应的条件,影响连接效率的因素有：A 温度（通常在415）B ATP的浓度(10ML)C 连接酶浓度（一般平末端大约需12U，黏性末端仅需0.1U）D 反应时间（通常连接过夜）E 插入片段和载体片段的摩尔比（1151）,（四）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案,1 连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2 10l体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例 的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA 分子摩尔数为1115），补足ddH2O 至8l。3 轻轻混匀，稍加离

27、心，56水浴5min后，迅速转入冰浴。4 加入含ATP的10Buffer 1l，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O补至10l，稍加离心，在适当温度（一般14 16）连接8-14hr。,粘性末端DNA片段的连接DNA连接酶连接法,Nick,Nick,平末端DNA片段的连接末端同聚物加尾法,3,3,5,5,3,3,5,5,DNA聚合酶和T4DNA连接酶,平末端DNA片段的连接衔接物连接法,衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸组成，具有有1个或几个限制性酶切位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。,GGATCCCCTAGG,+,BamHI切割,GATCCG,连接

28、酶经BamHI切割的pBR322,GCCTAG,BamHI衔接物,dsDNA,GGATCCCCTAGG,GGATCCCCTAGG,连接酶,重组DNA分子,GATCCG,GCCTAG,（一）大肠杆菌DNA聚合酶I（二）Klenow片段酶（三）T4 DNA聚合酶（四）逆转录酶（反转录酶）,三 DNA聚合酶及其应用,CCGGGCTATCGGA,A,T,A,G,CCT,CCGATAGCCTGGCTATCGGA,CCGATAGCCTGGCTA,T,1 5 3聚合酶活性：模板，带3OH游离基团的引物、4dNTPs、Mg2+2 双链特异性的53核酸外切酶活性3 35核酸外切酶活性：从游离的双链或单链DNA的

29、3端降 解。不过对于双链的降解可被5 3 的多聚活性所抑制。主要是校正作用,（一）大肠杆菌DNA聚合酶I（E.Coli DNA pol I）,Kornberg A.1956年首先从大肠杆菌E.Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括3种不同的酶活力：,大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途,A.利用缺口转移法制备高比活度的DNA探针 利用其5-3的外切酶活性及其聚合酶活性。B.用于DNA连接前的大缺口填充 利用5-3的聚合酶活性。C.用于DNA的序列分析 利用5-3的聚合酶活性。,大肠杆菌聚合酶I的应用示例,缺口转移制备探针,Pol I+Mg2+32P dNTPs,（二）Klenow

30、片段酶,Klenow片段是大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，分子量为76KD。酶催活性：53 的聚合酶活性35 的核酸外切酶活性,CCGATAGCCTGGCTA,Klenow片段的主要用途（利用5 3 的聚合酶活性）修补限制性酶消化DNA形成的3隐蔽末端标记DNA片段的末端 底物用32PdNTPs cDNA克隆中第二链cDNA的合成 DNA序列的测定,3隐蔽末端就是用限制性内切酶消化之后所形成的5端突出而3端向内凹的现象,（三）T4DNA聚合酶,T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离得到的。酶催活性：53的聚合酶活性35的核酸外切酶活性。其外切酶活

31、性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。比Klenow 片段酶强1001,000倍。可以综合利用这两种活性进行取代合成反应：如果反应体系中仅存在一种dNTP或没有底物时，这时T4DNA聚合酶就会表现出35外切酶活力，从双链DNA的3开始降解，直到露出底物dNTP相同的碱基。然后就在此位置发生合成和取代反应。,T4DNA聚合酶的用途,1 利用取代合成反应制备探针2 标记具有平末端的或具有3隐蔽末端的DNA片段 利用较强的3 5 外切酶活性和 53聚合活性3 用于DNA序列分析,（四）逆转录酶Reverse transcriptase,逆转录酶 是一种依赖RNA的DNA聚合酶。此酶首先是197

32、0年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的Nature杂志上。最普遍使用的是从鸟类骨髓母细胞瘤病毒（AMV）分离出来的。活性：一种可以有效地将mRNA反转录成DNA的酶，其产物称为 cDNA(complementary DNA).主要用途：将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。,（一）末端转移酶（terminal transferase）（二）SI核酸酶（SI nuclease）（三）碱性磷酸酶,四 修饰性工具酶,末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。特性：该类酶可以在没有模板链存在的情况下，将核苷酸连接到dsDNA或ssDNA的在3OH。特别是对

33、于平末端的双链DNA末端加尾十分有用。最常见的用途：给外源DNA片段及载体分子加上互补的同聚物尾巴，以创造黏性末端，便于重组。,（一）末端转移酶,平末端DNA片段的末端加尾连接法,3,3,5,5,3,3,5,5,DNA聚合酶和T4DNA连接酶,（二）SI核酸酶,这是一种从米曲霉（Aspergillus oryzae）中分离的高度单链特异的外切酶。活性：可以降解单链DNA或RNA或双链的单链区。,其主要用途有：在cDNA合成过程中，切开cDNA的发夹末端；载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴，形成平末端结构。,3 AAAAAAAA,发夹结构的切除,单链尾巴的切除,（三）碱性磷酸酶,从大肠杆菌

34、中分离的细菌碱性磷酸酶（Bacterial Alkaline Phosphatase）简称BAP。从小牛肠中分离的叫小牛肠碱性磷酸酶（Calf Intestinal Alkaline Phosphatase），简称CIP，用的广泛。酶催功能：脱磷酸作用，将单链或双链DNA或RNA5P转化成5OH。其主要用途有：在用32P标记DNA 5端之前，去除5端的磷；在DNA重组技术中，去除DNA片段的5磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。,载体去磷防止自连的应用示例,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,P,OH,P,OH,OH,OH,OH,OH,连接酶,连接酶,连接酶,碱性磷酸酶,CIP,寄主修复缺口,载体自连或产生二聚体等,基因工程的基本步骤,基因分离酶切,载体酶切,基因和载体连接,导入细菌,重组质粒繁殖,重组克隆的选择,序列分析和基因表达等研究,