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1、,高 频 考 点1.微生物的分离和培养。2.某种微生物数量的测定。3.培养基对微生物的选择作用。实 验 要 求1.培养基的种类、营养要求及配制原则。2.无菌技术的内容及方法。3.微生物的培养、分离和数量测定。,选修一第一章 微生物培养技术,(一)微生物实验室培养1培养基(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。(2)分类和应用,(3)培养基配方及营养要素基本营养要素：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐。此外还要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。,特别提醒：微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。对异养
2、微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源、能源。有些培养基不需要添加特殊营养物质，生物自己能合成，如大肠杆菌能合成某些维生素，作为特殊营养物质。制备：计算称量溶化灭菌倒平板。,2.无菌技术(1)消毒和灭菌的区别,特别提醒：用酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好，原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。(2)无菌技术主要操作要求实验前应对操作空间、操作人员消毒，对所用器具和培养基灭菌。实验进行时需在酒精灯火焰周围无菌区操作，另外要避免已灭菌处理材料再次污染。,3微生物的分离方法 方法一：平板划线法、稀释涂布平板法、稀释混合
3、平板法。(1)原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其生长成单个的菌落，则这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。(2)目的：分离由一个细菌繁殖而来的菌落。(3)菌落判断的依据：形状、大小、表面、边缘、隆起度、透明度、颜色等。(4)实例；从酒曲中分离酵母菌。,方法二：选择培养基分离法。(1)原理：使分离对象大量繁殖，抑制其他微生物的生长。(2)适用范围：分离的微生物在混合样品中数量较少时。(3)实例：分离分解纤维素的细菌。,(二)大肠杆菌分离与纯培养(以及菌种的保藏)(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。(2)纯化大肠杆菌原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，
4、使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。方法：平板划线法、稀释涂布平板法。平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面；稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。,(3)菌种的保藏短期保存：固体斜面培养基上4保存，菌种易被污染或产生变异。长期保存：20甘油管在冷冻箱中保藏。特别提醒：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的温度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,1分析下面培养基的配方：K
5、H2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O、葡萄糖、尿素、琼脂。请回答：(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是_和_。(2)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？_。,(3)培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌、消毒方法依次是()化学消毒灼烧灭菌干热灭菌紫外线灭菌高压蒸汽灭菌巴氏消毒法A BC D,解析：碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物质。所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。绝大多数生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以这种培养基对微生物有选择作用。选择的原则是只有能够利
6、用尿素的微生物才能够生长。培养基用高压蒸汽灭菌；培养皿能耐高温，可用干热灭菌；接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底的灭菌效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；空气可用紫外线消毒；牛奶为不破坏其营养成分可采用巴氏消毒法。,答案：(1)葡萄糖尿素(2)有选择作用。因为此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长(3)A,(一)原理：运用“选择培养基”(能让特定的被选择的微生物生长，抑制其他微生物生长，从而从混杂的微生物群体中分离出特定的微生物)从混杂微生物选择出特定微生物。(二)案例一 分解纤维素的微生物的分离,1纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、Cx酶和葡
7、萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。2纤维素分解菌的筛选原理(1)刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。(2)纤维素分解菌能产生纤维素酶分解纤维素，从而使菌落周围形成透明圈。,3土壤中纤维素分解菌的筛选流程土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落。,【深化拓展】1纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，因培养基中无凝固剂，利用液体选择培养基以增加纤维素分解菌的浓度。2为确定得到的菌种是否是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的发酵方法有液体发酵
8、和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。3流程中的“选择培养”是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定。,(三)案例二土壤中分解尿素的细菌的分离与计算(注：这是人教版生物的精典案例)1分离的原理(1)土壤中的细菌之所以能够分解尿素，是因为它们体内能合成脲酶。这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起催化作用。(2)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,2分离分解尿素的细菌所使用的特定培养基分离分解尿素的细菌的培养基应为选择培养基，培养基中的氮源只有尿素，
9、理论上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生长。其配方如下：KH2PO41.4 gNa2HPO4 2.1 gMgSO47H2O 0.2 g葡萄糖 10.0 g尿素(唯一氮源)1.0 g琼脂 15.0 g将上述物质溶解后，用自来水定容到1 000 mL。,3统计菌落数目的方法(1)显微镜直接计数法原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。,(2)间接计数法(活菌计数法)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。操
10、作a设置重复组，增强实验的说服力与准确性。b为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。,计算公式：每克样品中的菌株数 M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。4细菌分离与计数的实验流程土壤取样样品稀释取样涂布微生物培养观察并记录结果细菌计数,2(2009烟台模拟)可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是()A以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂B以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹试剂D以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂,解析：在以尿素为唯一氮源的培养基中，不能分解
11、尿素获得氮源的细菌不能生长，而分解尿素的细菌能利用尿素作氮源，将尿素分解为氨，使pH升高。若培养基中加入酚红指示剂，指示剂将变红。此培养基既属于选择培养基，又属于鉴别培养基。答案：A,3下图为分离并统计分解纤维素的微生物的实验流程，据此回答有关问题：(),(1)要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌，从高温热泉中寻找耐热菌，这说明_。(2)某同学根据需要，配制了纤维素分解菌的培养基如下，整个实验过程严格执行无菌操作。纤维素粉NaNO3Na2HPO47H2OKH2PO4 5 g 1 g 1.2 g 0.9 gMgSO47H2OKCl酵母膏、水解酪素 0.5 g 0.5 g 适量如果将其中的纤维素
12、粉换成_，菌落数_，即可说明选择培养基的作用。,(3)接种微生物最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，本实验宜采用_法，原因是_。,解析：(1)因为纤维素分解菌与耐热菌有不同的生活习性，生活在不同的环境中，故要根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。(2)因为葡萄糖是纤维素水解的、能被微生物直接利用的有机小分子，所以如果将其中的纤维素粉换成葡萄糖，纤维素分解菌及其他细菌会生长繁殖得更快，故菌落数明显多于选择培养基。(3)因为稀释涂布平板法要将菌液进行一系列的梯度稀释，故该法可根据稀释体积计算每克样品中的细菌数，而平板划线法则不能这样，所以本实验宜采用稀释涂布平板法。,答案：(1)根
13、据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找(2)葡萄糖明显多于选择培养基上的菌落数(3)稀释涂布平板平板划线法难以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数,特别提醒：在稀释平板计数法中，应注意设置重复组，增强实验的说服力与准确性。为了保证结果准确，统计菌落数时，细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿内有30300个菌落数为宜；霉菌以每个培养皿内有10100个菌落数为宜。参见下面例3,【例1】(2009全国卷)利用微生物分解玉米淀粉生产糖浆，具有广阔的应用前景。但现有野生菌株对淀粉的转化效率低，某同学尝试对其进行改造，以获得高效菌株。(1)实验步骤：配制_(固体、半固体、液体)培养基，该培养基的碳源应
14、为_。将_接入已灭菌的培养基平板上。立即用适当剂量的紫外线照射，其目的是_。,菌落形成后，加入碘液，观察菌落周围培养基的颜色变化和变化范围的大小。周围出现_现象的菌落即为初选菌落。经分离、纯化后即可达到实验目的。(2)若已得到两株变异菌株和，其淀粉转化率较高。经测定菌株淀粉酶的催化活性高，菌珠的淀粉酶蛋白含量高。经进一步研究发现，突变发生在淀粉酶基因的编码区或非编码区，可推测出菌株的突变发生在_区，菌株的突变发生在_区。尝试自解：_,思路点拨：依据获得高效转化淀粉的菌种的实验目的，确定在对细菌进行培育、筛选时，培养基中应以淀粉为唯一碳源，培养基类型应该是固体培养基。高产菌株培育的常用方法是人工
15、诱变，即利用紫外线、X射线、亚硝酸等物理或化学方法处理微生物，诱导其发生基因突变。转化淀粉效率高的菌落周围加碘液后，应该颜色浅且范围大。基因结构的非编码区主要控制基因的表达，人工诱变非编码区突变，可能提高(或降低)编码蛋白(淀粉酶)的产量；编码区则与蛋白质(淀粉酶)的分子结构有关，诱变可能提高酶的催化活性。,答案：(1)固体玉米淀粉野生菌株对野生菌株进行诱变处理浅色范围大(2)编码非编码解题技巧：本题是一道实验设计题，因以填空的形式进行考查，使实验设计的考查难度下降。答题时，应先整体阅读，以获得实验设计的主要思路和考查的主要内容。如实验步骤中培养基类型的选择，可以从本实验通过观察菌落筛选新菌种
16、得到启发，因为菌落必须在固体培养基中才能形成；从“现有野生菌株对淀粉的转化效率低”“获得高效菌株”确定培养基碳源应该使用淀粉等。,【例2】某生物兴趣小组进行研究性学习，探究“影响细菌生长繁殖的因素”。在培养细菌的过程中，发现某种细菌(记作R菌)周围的其他细菌的生长繁殖受到抑制，他们把R菌接种到专门的培养基上进行培养。一段时间后，他们除去R菌，用该培养基再培养其他细菌，结果，其他细菌不能在这个培养基上生长繁殖。(1)从生态学的角度分析，R细菌与周围细菌之间的关系是_。,(2)某同学假设了造成R菌周围的其他细菌不能生长繁殖的原因，你认为最可能的原因是_。AR菌占据了其他细菌的生存空间 BR菌吞噬了
17、其他细菌CR菌产生了不利于其他细菌生存的物质 DR菌更容易吸收培养基中的物质(3)参照上述题目中给出的有关材料，请设计一个实验，对第(2)问所做的选择进行验证，简述你的实验步骤及结论。,方法步骤：第一步：取两个培养皿，按相同营养成分分别配制甲、乙两个培养基。第二步：_。第三步：_。第四步：在相同条件下，让甲、乙两个培养基上的细菌生长繁殖。结果：_。结论：_。尝试自解：_,思路点拨：两种生物生活在一起，因食物和生活空间而进行斗争的现象称为竞争。在验证造成R菌周围其他细菌不能生长繁殖的原因的实验中，培养基中是否含有R菌产生的不利于其他细菌生存的物质是唯一变量(自变量)。如何证明R菌产生不利于其他细
18、菌生存的物质是本实验设计的关键点。在实验中，其中一个培养基上接种R菌，另一个培养基中不接种。培养一段时间后除去R菌(除去R菌的方法不做要求)，获得实验组，没有培养R菌的培养基作为对照组，再分别接种相同的其他细菌，培养后观察细菌的生长状况即可得出结论。,答案：(1)竞争(2)C(3)第二步：甲培养基上接种R菌，培养一段时间后除去R菌，乙培养基上不接种R菌，作为对照第三步：两个培养基分别接种相同的其他细菌甲培养基上的细菌的生长繁殖受到抑制，乙培养基上的细菌能正常生长繁殖R菌产生了不利于其他细菌生长繁殖的物质,技巧提示：微生物的相关实验设计，往往以微生物培养和分离技术为核心，配制一定的培养基并改变一
19、定的条件，通过微生物培养和观察，得出相应的结论。要特别注意遵循单因子变量原则，即实验组和对照组相比只能有一个变量，因此在设计对照组实验时首先要确定自变量并加以正确设置，至于将谁作为自变量则很容易确定，也就是要把所要验证的中心条件作为自变量。,【例3】下面是探究如何从土壤中分离自生固氮菌与计数的实验，完成下列问题：(1)实验原理：农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表层土制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。(2)材料用具：农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛9 mL无菌水的试管
20、、无菌吸管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛90 mL无菌水的锥形瓶、恒温箱。,(3)方法步骤：倒平板：分别将无菌培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，操作过程应在火焰旁。制备土壤稀释液：取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1 mL，转至9 mL的无菌水的大试管中，依次稀释到107稀释度。涂布：按照由107103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基一般应至少涂布_个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布1个平板。,培养：放入恒温箱内，在2830下培养34天。细菌的计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数为_的平板进行计数。如果测试的平均值为5
21、0，则每克样品中的菌落数是_(稀释度是105)。(4)预测结果：相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨培养基平板上的菌落数应多于无氮培养基上的数目。请说明原因_。尝试自解：_,思路点拨：统计菌落数目的原则是：选出菌落数在30300的平板进行计数。根据计算方法“每克样品中的菌落数(CV)M”，则(500.1)1055107。无氮培养基里没有氮源，只允许固氮菌生存，属于选择培养基，可分离出土壤中的固氮菌。牛肉膏蛋白胨培养基营养全面，几乎允许土壤中所有菌类生存。答案：(3)3 303005107(4)无氮培养基上能生存繁殖的仅是土壤中的固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类生存,友情提醒：微生物分离的常用方法：(1)培养基中的营养成分的改变可达到分离微生物的目的。如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物。(2)当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离出能消除石油污染的微生物的目的。(3)改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养，只能得到耐高温的微生物。,点击此处进入 随堂双基演练,谢谢,
