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1、上次教学回顾,第三节 微生物独特合成代谢途径举例自养微生物的CO2固定生物固氮（）肽聚糖的生物合成（）微生物次生代谢物的合成第四节 微生物的代谢调节与发酵生产,固氮微生物固氮的生化机制好氧菌固氮酶避氧害机制,在细胞质中的合成在细胞膜中的合成在细胞膜外的合成,微生物的代谢调节代谢调节在发酵生产中的应用,一、教学目的与要求了解微生物的生长规律，掌握测定微生物生长繁殖方法，熟悉环境因素对微生物生长的影响二、教学内容：1、测定生长繁殖的方法2、微生物的生长规律()3、影响微生物生长的主要因素()4、微生物的培养法概论5、有害微生物的控制(),第六章 微生物的生长,第六章 微生物的生长,个体繁殖,个体生
2、长,群体生长,第一节测定生长繁殖的方法,一、测生长量一)直接法(粗放的)测体积法(精确的)称干重法二)间接法比浊法：分光光度法，450650nm波段生理指标法：测含氮量法(细菌N%为12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.5%)；测含碳量;测磷、DNA、RNA、ATP、DAP等；产酸、产气、耗氧、粘度和产热等。,三、微生物生长繁殖的测定方法,二、计繁殖数适宜于测定单细胞的细菌和酵母菌，而对放线菌和霉菌等丝状的微生物而言，只能计算其孢子数。一)直接法指用计数板(如血球计数板)在光学显微镜下直接观察细胞进行计数的方法。为包括死细胞在内的总菌计数法。为此，有用特殊染料作活菌染色后再用光学显微镜计数的
3、方法(如酵母+美蓝液；细菌+吖啶橙)二)间接法是一种活菌计数法。平板菌落计数法：浇注平板法、涂布平板法厌氧菌的菌落记录数法：亨盖特滚管培养法,细菌计数板和血球计数板都用来测微生物的总菌数。血球计数板用来测较大微生物如酵母菌和霉菌孢子的总数，细菌计数板用来测细菌的总菌数。两种计数板的构造相似，不同的是细菌计数板的深度仅为血球计数板深度的1/5。,直接法血球记数板,间 接 法平板菌落计数法,涂布平板法,浇注平板法,第二节 微生物的生长规律,一、微生物的个体生长和同步生长同步培养法能使培养物中所有微生物细胞都处于相同生长阶段的培养方法。同步生长通过同步培养的手段使细胞群中各个体处于分裂步调一致的生长
4、状态。获得方法1、环境条件诱导法用氯霉素抑制细菌蛋白质的合成；细菌芽孢诱导发芽；用EDTA或离子载体处理；藻类细胞的光照、黑暗控制等。2、机械筛选法用过滤、密度梯度离心法或膜洗脱法,A：膜洗脱法B：密度梯度离心,常用同步培养方法,第二节 微生物的生长规律,二、无分支单细胞微生物的典型生长曲线生长曲线：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线。典型生长曲线：当把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的培养条件下，以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，就可画出一条由延滞期、指数期、稳定期和衰亡期 4个阶段组成的曲线。,根据微生物的生长速率常数，即每小时分裂次数（
5、R）的不同粗分,微生物的典型生长曲线,总菌数,活菌数,培养时间/h,延滞期 指数期 稳定期 衰亡期,(+)0(-),一)延滞期,概念又称停滞期、调整期或适应期。指少量单细胞微生物接种到新鲜培养液中后，在开始一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，细胞数目没有增加的一段时期。特点生长速率常数为零;细胞形态变大或增长;细胞内的RNA尤其是 rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性;合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加速，易产生各种诱导酶;对外界不良条件如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等理、化因素反应敏感。,一)延滞期,影响延滞期长短的因素菌种接种龄指接种物或种子的生长年龄，亦即它生长到生长曲线上
6、哪一阶段时用来作种的。是指某一群体的生理年龄。对数期接种龄的种子接种，则子代延滞期短；延滞期或衰亡期种子接种，则子代延滞期长；稳定期种子接种，则延滞期居中。接种量接种量大，则延滞期短，反之则长。培养基成分发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量接近,二)指数期,概念又称对数期，指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。特点 生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需时间-代时(世代时间或增代时间)或原生质增加一倍所需的倍增时间最短。细胞进行平衡生长，故菌体各部分的成分十分均匀酶系活跃，代谢旺盛。,二)指数期,影响指数期长短的因素：菌种营养成分营养丰富的培养基上，指数期较短营养
7、物浓度：影响生长速度和总生长量营养物浓度很低时，才会影响生长速度；营养物浓度增高，生长速度不受影响，而只影响最终的菌体产量；若进一步提高营养物浓度，则生长速度和菌体产量均不受影响。,时间,生长速度和最大收获量受影响,只最大收获量受影响,8.0mg/mL,6.0mg/mL,4.0mg/mL,2.0mg/mL,1.0mg/mL,0.5mg/mL,0.2mg/mL,0.1mg/mL,细胞数或菌体量,生长限制因子：凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物。培养温度温度接近最适生长温度，则指数期短。,二)指数期,实践意义此期的微生物因其具有整个群体的生理特性较一致、细胞各成分平衡和生长速率
8、恒定等优点，故是用作代谢、生理等研究的良好材料，是增殖噬菌体的最适宿主，也是发酵工业中用作种子的最佳材料。,三)稳定期,概念又称恒定期或最高生长期特点 生长速度常数R=0；菌体产量达到最高点，且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系；细胞内开始积累糖原、异染颗粒和脂肪等内含物，产芽孢杆菌在此形成芽孢；抗生素等各种次生代谢物合成。,三)稳定期,稳定期到来的原因营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调；酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；pH、氧化还原电位等物理化学条件越来越不适宜等。实践意义以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物为目的时，稳定期是产物的最佳收获期；若以维
9、生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定时，稳定期为最佳的测定时期。,四)衰亡期,概念处于稳定期的细菌继续培养，细胞的死亡率将逐渐增加，最终群体中活的细胞数目将以对数速率急剧下降的时期特点微生物的个体死亡速度超过新生速度，整个群体呈现负生长状态，R为负值。细胞形态发生多形化，例如会发生膨大或不 规则的退化形态；有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶；有的微生物在这期会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物；而在芽孢杆菌中，往往此时释放芽孢。,四)衰亡期,原因与菌种的遗传特性有关外界环境(营养、能源环境毒性等)对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢，继而导致大量菌
10、体死亡。,注意几个概念,菌龄接种量代时（世代时间，增代时间和倍增时间）生长限制因子,指数期三个重要参数的关系,1、繁殖代数（n）指数生长可以用下式表示 b=B2n式中：B:起始细胞数目 b:指数生长某个时刻 t时的 细胞数目 n 为繁殖代数B,b和t可由试验获得，n可通过上式计算得出，将等式两侧取对数重排后得：lgb=lgB+nlg2 lgb-lgB lgb-lgB lg2 0.301 3.322(lgb-lgB),n,例如：一培养液中微生物数目由开始的12,000(B)，经4h(t)后增加到49,000，000(b)，这样，n(lg4.9107lg1.2104）3.32212,2、生长速率常
11、数（R）n 3.322(lgb-lgB)t2-t1 t2-t1,R,指数期三个重要参数的关系,n=3.322(lgb-lgB),3、代时(G):G1/R(t2-t1)/n在本例中，G460/1220min该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。,代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。,研究代时的意义：,影响微生物代时长短的因素,菌种不同菌种差别很大。多数微生物的代时为13h，然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min，而另一些微
12、生物的代时却可长达几小时或几天。营养成分同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同。营养物浓度生长限制因子影响生长速率和总生长量培养温度影响极大发酵实践、食品包藏和防止食物变质和中毒,一些细菌的代时,菌名 培养基 培养温度 代时()(min)E.coli（大肠杆菌）肉汤 3717E.coli 牛奶 3712.5Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）肉汤或牛奶 371618E.aerogenes 组合 372944B.subtilis（枯草芽孢杆菌）肉汤 37 26-32S.aureus（金黄葡萄球菌）肉汤 3727-30Lactobacillus acidophil
13、us（嗜酸乳杆菌）牛奶 376687Streptococcus lactis（乳酸链球菌）牛奶 3726S.Lactis 乳糖肉汤 3748Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）肉汤 3723.5Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 792993Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌）组合 271200,不同温度下的代时,如：E.Coli 在不同温度下的代时温度（）代时（分）温度（）代时（分）10 860 35 22 15 120 37 17 20 90 40 17.5 25 40 45 20 30 29 47.5 77,本次教学
14、回顾及作业,教学回顾 6-1 测定生长繁殖的方法测生长量直接法（干重法）、间接法（比浊法、生理指标法）计繁殖数直接法（显微镜计数法）、间接法（平板菌落计数法、厌氧菌的菌落计数法）6-2 微生物的生长规律微生物的个体生长和同步生长单细胞微生物的典型生长曲线作业 P187 2，5,上次教学回顾,6-1 测定生长繁殖的方法测生长量计繁殖数6-2 微生物的生长规律微生物的个体生长和同步生长单细胞微生物的典型生长曲线,直接法（干重法）间接法（比浊法、生理指标法）,直接法（显微镜计数法）间接法（平板菌落计数法）,延滞期指数期稳定期衰亡期,注意几个概念：同步生长、典型生长曲线、延滞期、指数期、稳定期、衰亡期
15、、接种龄、接种量、繁殖代数、生长限制因子,第二节 微生物的生长规律,三、微生物的连续培养一)分批培养与连续培养分批培养概念：即单批培养或密闭培养。指将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方式。特点：培养基一次加入，不予 补充和更换连续培养概念：又称开放培养。即在一个恒定的流动系统中培养微生物，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和衡 定的生长速率上，于是形成了连续生长。,连续培养,指数期后期,以一定的速度流入新鲜培养基和无菌空气,立即搅拌均匀,以同样的流速不断流出培养物,培养物就可达到动态平衡,类型：主要有恒浊连续培养和恒化连续培养两种,恒浊连续培养,装置：恒
16、浊器概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。原理：通过调光电控制系统控制新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快；浊度降低，则减慢培养基的流速。特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,培养液贮备瓶,恒浊器,培养菌液,恒化连续培养,装置：恒化器概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终
17、成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。应用范围：实验室科学研究,恒浊连续培养与恒化连续培养的比较,单批培养,连续培养,时间,Lg细胞数/个mL-1,连续流入新鲜培养液,单批培养,恒浊法,恒化法,连续培养,单批培养与连续培养的关系,连续发酵（continuous fermentation）,连续发酵：指连续培养在生产上的应用。与单批发酵相对。优点高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等操作；自控：便于利用各种仪表进行自动
18、控制；产品质量稳定；节约大量动力、人力、水和蒸汽，使水、汽、电的负荷均衡合理。缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。因此，连续发酵的生产时间一般只能维持数月 1年。,第二节 微生物的生长规律,四、微生物的高密度培养概念有时也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规10倍以上时的生长状态或培养技术。主要发展于用基因工程菌(E.coli)(高密度值：200400g(湿重)/L)生产多肽类药物；微生物种类E.coli和S.cerevisiae等少数兼性厌氧菌,第二节 微生物的生长规律,四、微生物的高密度培养具体方法选取最佳培养基成分含量注意营养物浓度及比
19、例，尤其是C/N比补料一般应采用逐量流加的方式提高溶解氧的浓度提高氧浓度甚至用纯氧防止有害代谢产物的生成选用天然培养基，降低培养基的pH,以甘油代替葡萄糖、加入甘氨酸、甲硫氨酸，降低培养温度，采用透析培养法等,本次教学回顾及作业,教学回顾 6-1 测定生长繁殖的方法测生长量计繁殖数6-2 微生物的生长规律微生物的个体生长和同步生长无分支的单细胞微生物的典型生长曲线微生物的连续培养微生物的高密度培养作业 P187 2，5，7,6-1 测定生长繁殖的方法测生长量计繁殖数6-2 微生物的生长规律微生物的个体生长和同步生长无分支的单细胞微生物的典型生长曲线微生物的连续培养微生物的高密度培养,上次教学回
20、顾,直接法间接法,直接法间接法,诱导法筛选法,延滞期指数期稳定期衰亡期,恒浊法恒化法,第三节 影响微生物的生长的主要因素,一、温度二、氧三、pH值,温度对微生物的影响具体表现在：影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。影响物质的溶解度，对生长有影响。,一、温度,一、温度,生长温度三基点最低生长温度、最适生长温度、最高生长温度,最低：,最适：,最高：,嗜冷菌：20(一般为15),中温菌(20-45),室温菌：约25,体温菌：约37,嗜热菌：
21、45(一般为50-60),一般为-10-5，极端为-30,一般为8095，极端为105150,为某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。注意：此温度并非一切生理过程的最适温度。,生长得率最高时的培养温度发酵速率或累积代谢产物最高时的培养温度累积某代谢产物最高时的培养温度,最适生长温度并非一切生理活动的最适温度,例如：青霉素生产的四阶段控制，根据不同生理代谢过程的温度特点，比30 恒温提高14.7%。0hr5hr(30)5hr40hr(25)40hr125hr(20)125hr165hr(25),二、氧气,好氧菌,厌氧菌,专性好氧菌：,兼性厌氧菌,微好氧菌：,需氧，在常压通过呼吸产能,以呼吸
22、为主(有氧)，兼营发酵产能(无氧),以呼吸为主(有氧)，兼营厌氧呼吸产能(无氧),微生物与氧的关系：,需在微量氧下生活,耐氧菌：,不需氧，只以发酵产能，氧无毒害,(专性)厌氧菌：,氧有害或致死，以发酵或无氧呼吸产能,氧浓度对不同微生物生长的影响,图6-7分子氧浓度和分压对3类微生物生长的影响,5类微生物在半固体琼脂柱中的生长状态模式图,判断某菌是否有运动能力和其他特征,好氧菌,兼性厌氧菌,微好氧菌,耐氧菌,厌氧菌,图6-85类对氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态模式图,5类微生物的比较,厌氧菌的氧毒害机制SOD学说,严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物
23、的毒性而死亡。在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中间产物，例如：过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2）等。O2为活性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极不稳定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶（SOD）等；而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。,H2O+O22 O2+2H+O2+H2O22H2O,O2+eO2(O2，O2)超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成。超氧化物歧化酶(SOD)是在生物进化中发展出来的一种自我保护方式。其作用机制为：,生物体中超氧阴离子
24、的形成与去除,12,SOD好氧生物和耐氧菌,过氧化氢酶 好氧生物,过氧化物酶 NADH2NAD耐氧菌,实验证明：兼性厌氧菌E.coli在发生SOD缺失突变后，就会变成一种“严格厌氧菌”。,氧气影响的实践意义,在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气，同时在培养基中添加还原剂，降低培养基中的氧化还原电位势。培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。,三、pH值,微生物生长的外界环境中pH范围极广大多数生长pH为5-9，少数生长于 pH 10最低pH、最适pH和最高pH微生物生长的内界环境中p
25、H却相当稳定一般都接近中性微生物的生命活动也能改变外界环境中pH,培养基内中性成分,有机物,无机物,糖类,脂肪,蛋白质,(NH4)2SO4,NaNO3,有机酸,胺类,H2SO4,NaOH,变碱,变酸,发酵、氧化,水解,脱羧,NH4+选择吸收,NO3-选择吸收,三、pH值,p H值的调节,“治标”,“治本”,过酸时:,过碱时:,加NaOH、Na2CO3等碱液中和,加H2SO4、HCl等酸液中和,过酸时:,过碱时:,加适当氮源如尿素、NH4OH等,提高通气量,加适当碳源如糖、乳酸、油脂等,降低通气量,外源调节,内源调节,讨论题试分析影响微生物生长的因素？1）物理因素：温度、水分、渗透压、光线、微波
26、和超声波2）化学因素：营养元素、pH值、氧气和氧化还原电位、无机盐类、某些化学物质。注意：具体从最适、过高或过低三方面分析。,第四节微生物培养法概论,良好微生物培养装置的基本条件设计基础：微生物的生长规律基础：营养物质丰富而均匀环境条件温度通气条件（厌氧菌除外）物理化学因素有效防止杂菌污染,第四节微生物培养法概论,微生物培养技术发展轨迹的特点：少量培养到大规模培养浅层培养到厚层或深层液体培养固体培养到液体培养静止培养到通气搅拌液体培养单批培养到连续培养到多级培养分散到固定化细胞微生物细胞到动植物细胞培养野生菌种到突变、遗传工程菌种单菌发酵到混菌发酵低密度到高密度人工控制发酵罐到多传感器、计算机
27、在线控制自动发酵,第四节微生物培养法概论,一、实验室培养法一）固体培养法、好氧菌的固体培养法主要用试管斜面、培养平板及较大型的克氏扁瓶、茄子瓶等、厌氧菌的固体培养法：需要特殊的培养装置或器皿和特殊的培养基（其中除6大营养要素外，还得加入适当的还原剂，必要时还需加刃天青等氧化还原指示剂）。(1)高层琼脂柱把含有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，灭菌培养，如韦荣氏管。(2)厌氧培养皿,第四节微生物培养法概论,一、实验室培养法一）固体培养法、厌氧菌的固体培养法：(3)亨盖特滚管技术原理：利用除氧铜柱来制备高纯氮，再用此高纯氮去驱除培养基配制、分装过程中各种容器和小环境中的空气，使整个培养全过程始
28、终处于高度无氧条件下。培养基：预还原无氧灭菌培养基（PRAS培养基）培养方法：密封后置冰浴中均匀滚动，使含 菌培养基布满在试管内表面上。优点：试管内壁上的琼脂层有很大的表面积可供厌氧菌长出单菌落，但试管口的面积和试管腔体积都极小，因而特别有利于阻止氧与厌氧菌接触。,第四节微生物培养法概论,一、实验室培养法一）固体培养法、厌氧菌的固体培养法：(4)厌氧罐技术是一种经常使用但不是很严格的厌氧菌培养技术。因为它仅能保证厌氧菌在培养过程中处于良好的无氧环境。一般操作步骤（抽气换气法）：抽真空灌N2 抽真空灌N2 抽真空灌混合气体（N2:CO2:H280:10:10，V/V）“GasPak”内源性产气袋
29、(5)厌氧手套箱技术混合气体（N2:CO2:H285:5:10，V/V）和钯催化剂,厌 氧 罐,厌氧手套箱,第四节微生物培养法概论,一、实验室培养法二）液体培养法、好氧菌的液体培养法试管液体培养三角瓶浅层液体培养摇瓶培养台式发酵罐、厌氧菌的液体培养法放入前述厌氧罐或厌氧手套箱中培养即可若单独在有氧环境下培养，则在培养基中必须加入巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C或庖肉等有机还原剂，或加入铁丝等无机还原剂，再用深层培养或同时在液面上封一层石蜡油或凡士林-石蜡油，保证其Eh=-150mV-420mV,第四节微生物培养法概论,二、生产实践中培养微生物的装置一）固态培养法1、好氧菌的曲法培养（瓶曲、袋曲、盘
30、曲、帘子曲、转鼓曲通风曲）,曲的构成与功能,固体基质,菌体（菌丝、孢子或细胞）,代谢产物,提供营养源,有利于疏松通气,赋于曲的外形,：可用作“种子”,外酶类：可用作粗酶制剂,其他：如柠檬酸、赤霉素和抗生素等,第四节微生物培养法概论,二、生产实践中培养微生物的装置一）固态培养法2、厌氧菌的堆积培养我国的传统白酒生产中采用大型深层地窖对固态发酵料进行堆积式固态发酵（有利于酵母菌的酒精发酵和己酸菌的己酸发酵）。,第四节微生物培养法概论,二、生产实践中培养微生物的装置二）液体培养法1、好氧菌的培养1）浅盘培养：用大型盘子对好氧菌进行浅层液体静止培养的方法2）深层液体通气培养：应用大型发酵罐进行深层液体
31、通气搅拌的培养技术，为现代发酵工业的标志。,瑞士比欧公司小型发酵罐,中式发酵罐,本次教学回顾及作业,教学回顾 6-3 影响微生物生长的主要因素温度氧气pH6-4 微生物培养法概论实验室培养法生产实践中培养微生物的的装置作业 P187 9，10，14,上次教学回顾,6-3 影响微生物生长的主要因素温度氧气pH6-4 微生物培养法概论实验室培养法生产实践中培养微生物的的装置,最高生长温度最适生长温度最低生长温度,专性好氧菌兼性厌氧菌微好氧菌耐氧菌厌氧菌,最高生长pH最适生长pH最低生长pH,超氧化物岐化酶（SOD）学说,第五节 有害微生物的控制,控制有害菌的措施,杀灭法,抑制法,灭菌,消毒,彻底杀
32、灭(一切微生物),部分杀灭(仅杀灭病原菌),杀菌,溶菌,防腐,化疗,抑制霉腐微生物,抑制宿主体内的病原菌,防腐方法,低温4以下的各种低温（0,-20,-70,-196等）保藏食物、生化试剂、生物制品或菌种等；缺氧抽真空、充氮气或二氧化碳、加入除氧剂等；干燥晒干、烘干、红外线干燥、添加生石灰、无水氯化钙或硅胶等作吸湿剂等；高渗：盐腌和糖渍高酸度：如泡菜高醇度：如醉蟹、醉笋、黄泥螺等加防腐(霉)剂：苯甲酸、尼泊金（对羟基苯甲酸甲酯）等,一、物理方法的控制,一)高温灭菌和消毒原理：引起蛋白质、核酸和脂类等重要生物高分子发生降解或改变其空间结构等，从而变性或破坏。,干热灭菌法,湿热灭菌(消毒)法,火焰
33、灼烧法,烘箱内热空气灭菌法,常压,加压,巴氏消毒法,煮沸消毒法,间歇灭菌法,常规加压灭菌法,连续加压灭菌法,干热灭菌,原理利用热空气，使细胞膜破坏，蛋白质变性和原生质干燥，并使各种细胞成分发生氧化变质烘箱内热空气法：在电热烘箱内时间和温度：171，1hr；160-170，2hr；121，12hr适用对象：金属、玻璃器皿，油料和粉料物质火焰灼烧法：酒精灯或煤气灯适用对象：接种环、接种针和试管口及医院等烧毁带病原菌的 材料和动物尸体等,湿热灭菌,原理利用蒸汽进行灭菌。在同样温度和作用时间下，湿热灭菌法比干热灭菌法的效率高。因为：热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强；热蒸汽比热空气穿透力强，能更有效地杀灭
34、微生物；蒸汽存在潜热。1、常压法巴氏消毒法：一般在60-85 处理30min至15s.低温维持法(LTH)：63 维持30min高温瞬时法(HTST)：72维持15s煮沸消毒法：在100 下煮沸数分钟间歇灭菌法：分段灭菌法或丁达尔灭菌法将不耐热的培养基放在80-100 下蒸煮15-60min；然后 放于室温或37 下保温过夜，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此重复3天即可,湿热灭菌,2、加压法常规加压蒸汽灭菌法：一般称“高压蒸气灭菌法”，但因其压力范围很低(仅在1个大气压左右)，故改用“加压”更合适。是一种利用高温(而非高压)进行湿热灭菌的方法。原理：在121(压力为1kg/cm2)下维持15
35、-20min(或112-115 下维持35min)适用于一般培养基、生理盐水等各种溶液、工作服及实验器材等连续加压蒸汽灭菌法在发酵行业中也称“连消法”，仅用于大型发酵厂大批培养基灭菌原理：让培养基在管道的流动过程中快速升温、维持和冷却，然后流进发酵罐。培养基一般加热135-140 下维持5-15s,高温灭菌的定量指标,热死时间在某一温度下，杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间。热死温度双称热死点，指在一定时间 内（一般为10min），杀死某微生物的水悬浮液群体所需的低温度。,湿热灭菌,影响加压蒸汽灭菌效果的因素1、灭菌物体的含菌量含菌量越高，需要的灭菌时间越长。2、灭菌锅内空气排除程度混有
36、空气的蒸汽与纯蒸汽相比，其压力与温度的关系很不相同，因此，必须先彻底排尽锅内的空气。3、灭菌对象的pH值灭菌对象的pH6.0时，易死亡；在6.0-8.0，不易死亡4、灭菌对象的体积5、加热与散热速度,高温对培养基的影响及其防止,1、高温对培养基的有害影响,高温的有害影响,形成沉淀物,破坏营养，提高色泽,有机物,无机物,如多肽类沉淀,如磷酸盐、碳酸盐等沉淀,褐变,毒变,产生氨基糖、焦糖或黑色素,(？),改变培养基的pH,一般为降低pH,降低培养基浓度,气温低时会增加冷凝水,高温对培养基的影响及其防止,2、防止高温方法采用特殊加热灭菌法分别灭菌；低压灭菌；连续加压蒸气灭菌过滤除菌法滤器：（滤膜过滤
37、器、烧结玻璃板过滤器、石棉板过滤器、素烧餈过滤器和硅藻土过滤器等）缺点：无法滤除液体中的病毒其它方法按配方顺序加入；加入适量螯合剂；气体灭菌剂,二、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,评价药效和毒性的3种指标最低抑制浓度(MIC)半致死剂量(LD50)最低致死剂量(MLD),化学因素,表面消毒剂,化学治疗剂,溶液状态,气体状态,抗代谢药物：磺胺类等,抗生素,生物药物素,二、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,一)表面消毒剂表面消毒剂：可抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用的化学试剂。防腐剂：可抑制微生物生长，但对人体或动物体的毒性较低的化学试剂。石炭酸系数：指在一定时间(10min)内，被测试药剂能杀
38、死全部供试菌(伤寒沙门氏菌)的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度之比。注意：石炭酸系数仅有一定的参考价值。,常用的消毒防腐剂及其应用,常用的消毒防腐剂及其应用（续）,常用的消毒防腐剂及其应用（续）,小知识：红药水、紫药水和碘酒、碘酊不可同用；紫药水不宜用来涂擦化脓性伤口。红药水杀菌力弱且含汞；碘消毒剂如碘酒、碘伏等杀菌能力强，毒性较小。,二、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,二)化学治疗剂概念：指能够特异性地作用于某些微生物并具有选择性毒性的化学药剂。分类1、抗代谢药物（代谢拮抗物或代谢类似物）定义是指一类在化学结构上与细胞内必要代谢物的结构相似，可干扰正常代谢活动的化学物质，具有选择毒力。都
39、是有机合成药，主要为生长因子类似物如：磺胺类、氨基叶酸、异烟肼、6-巯基腺嘌呤等,二、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,二)化学治疗剂分类1、抗代谢药物作用与正常代谢物一起共同竞争酶的活性中心，从而使微生物正常代谢所需的重要物质无法正常合成。例如：磺胺(对氨基苯甲酸类似物)竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，阻止叶酸合成，抑制细菌生长。“假冒”正常代谢物，使微生物合成出无正常生理活性的假产物。与某一生化合成途径的终产物的结构类似，可通过反馈调节破坏正常代谢调节机制。,二、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,二)化学治疗剂分类2、抗生素定义是一类由微生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其人工衍生物，它们
40、在很低浓度时就能抑制或干扰它种生物(包括病原菌、病毒、癌细胞等)的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂。种类抑制细胞壁的合成或降解 干扰细胞膜的生成 抑制蛋白质的合成 抑制核酸的合成,主要抗生素和化学治疗剂的作用模型图,四氢叶酸,二氢叶酸,对氨基苯甲酸(PABA),叶酸代谢磺胺药三甲基苄二氨喀嚓(TMP),细胞壁合成青霉素万古霉素杆菌肽环丝氨酸头孢菌素,抑制DNA合成新生霉素萘啶酮酸诺氟沙星,DNA,mRNA,核糖体,tRNA,50,30,50,30,50,30,抑制DNA复制丝裂霉素,抑制RNA合成放线菌素利福平利福霉素,抑制蛋白质合成红霉素氯霉素林可霉素四环素壮观霉素链霉素卡拉霉素嘌呤霉素
41、,抑制细胞膜的合成多粘菌素短杆菌素,细胞膜对药物的通透性和吸收能力降低,激活膜上抗药泵蛋白将进入到胞内的药物泵出胞外,合在某种酶将药物修饰成无活性的形式,药物靶分子发生改变使药物不再发挥作用,抗药机制结构发生改变导致某类药物作用的结构缺失,微生物的抗药性,概念微生物的抗药性就是微生物能够抵抗化学药物作用而正常生长的能力。,自发突变和自然选择的结果，时间长才明显,即R质粒，是一种接合质粒，可带有一个或多个药物抗性基因。,微生物的抗性是由染色体或质粒DNA所编码的,二、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,二)化学治疗剂分类2、抗生素活力称为效价，其计量一般用“单位”表示。规定各种抗生素的1mg游离碱为10
42、00单位。（其不同的盐类根据相对分子质量大小来折算其效价）。抗菌谱：抗生素的作用范围广谱抗生素：四环素、土霉素、氯霉素、金霉素等狭谱抗生素：青霉素、红霉素主要抗G菌；链霉素、新霉素主要抗G菌；庆大霉素、万古霉素和头孢霉素主要抗G和G菌；放线菌酮、制霉菌素等主要对真菌有抑制作用。,二、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂,二)化学治疗剂分类3、半合成抗生素与生物药物素半合成抗生素：对天然抗生素的结构进行人为改造后的抗生素生物药物素：其它具多种生理活性的微生物次生代谢物如各种酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗 剂和抗氧化剂等。,本次教学回顾及作业,教学回顾6-5 有害微生物的控制物理方法的控制高温灭菌和消毒干热灭菌和湿热灭菌化学方法的控制化学杀菌剂、消毒 剂和治疗剂作业P18716，17，20,
