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1、第四章 白细胞抗原检测 第五章 血小板血型系统 第六章 血小板血型检测技术黄冈市中心医院 肖华,人类白细胞抗原(HLA),HLA抗原分布相当广泛，见于所有的有核细胞上，但在淋巴细胞上的密度最高血小板上的HLA抗原是血小板膜表面的固有结构成分，主要是HLA-I类的A、B位点的抗原,HLA-I类抗原是引起血小板同种免疫和血小板输注无效的主要抗原，约占80%,HLA抗原检测技术,人类白细胞抗原检测技术已广泛应用于器官移植前的组织配型检测方法：血清学方法、细胞学方法和基因分型方法与临床输血的关系HLA抗原可引起免疫应答HLA抗体发热性非溶血性输血反应和血小板输注无效,HLA血清学方法,血清学方法：是用
2、一系列已知的抗HLA抗原的标准血清来检测未知淋巴细胞表面的HLA抗原型别。,原理：淋巴细胞膜表面具有HLA抗原，而分型血清中含有抗特定HLA抗原的细胞毒抗体，该抗体与淋巴细胞膜上的相应的HLA抗原结合后在补体的参与下损伤细胞膜，经染料染色后，通过观察细胞是否被染色来判断待测细胞是否损伤或死亡，进而判断抗原、抗体反应的强度。,微量淋巴毒实验,微量淋巴细胞毒试验记分,抗血清的来源和标准,通过妊娠、输血和同种器官移植等免疫作用产生HLA同种抗体使用纯化的HLA抗原免疫动物，可产生HLA异种抗体使用杂交瘤技术，可获得单克隆抗体少数存在的天然抗体,质量标准,1.血清特异性程度（FP3%，FN14%）2.
3、血清的强度，采用强度指数SI表示，SI70%,HLA细胞学方法,纯合细胞分型方法预致敏淋巴细胞试验混合淋巴细胞培养,纯合细胞分型方法,该方法的原理为带有A/A纯合抗原的细胞（HTC）作为刺激细胞，带有未知抗原X/X的检测细胞作为应答细胞，在两种细胞组成的单向混合淋巴细胞培养反应（MLC）中，如果发生刺激反应，表明受检细胞能够识别A抗原当成外来抗原，所以受检细胞不具有A抗原，反之受检细胞可能是A抗原的 杂合子或纯合子,预致敏淋巴细胞试验,在应答细胞A与刺激细胞B的初次混合淋巴细胞培养反应(MLC)中，经过9-12天培养，应答细胞A增生为淋巴细胞后变成小淋巴细胞，即为预致敏淋巴细胞（PL）,混合淋
4、巴细胞培养,两个无关个体的淋巴细胞，在体外适当的 环境下混合培养后可以互相激发，使细胞活化并向母细胞转化，产生分裂增生现象，即为混合淋巴细胞培养方法（MLC）。现MLC主要用于实体器官移植前的快速相容性检测。分双向MLC和单向MLC,HLA基因分型方法,PCR限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）序列特异性引物PCR（PCR-SSP）PCR序列特异性寡核苷酸探针分型技术（PCR-SSO）PCR单核苷酸序列分析（PCR-SBT）基因芯片流式细胞术,粒细胞抗原、抗体检测,血清学方法粒细胞凝集试验（GAT）粒细胞免疫莹光试验（GIFT）单克隆抗体特异性粒细胞抗原捕获试验（MAIGA）ELISA方法
5、流式细胞术,基因分型技术,主要方法为PCR-RFLPPCR-SSP PCR-SSO等1、PCR序列特异性引物2、PCR限制性片段长度多态性,血小板血型抗原,血小板血型抗原主要有两大类：血小板相关抗原 血小板特异性抗原。,血小板相关抗原：血小板表面存在的与其他细胞或组织共有的抗原血小板特异性抗原（HPA）：通常将血小板表面由血小板特有的抗原决定簇组成，表现出血小板特有的遗传多态性，并且不存在于其他细胞和组织上的抗原。,血小板相关抗原,1、红细胞血型抗原：血小板上的ABH抗原物质，包括机体所产生的以及由血浆中黏附在血小板表面的两类抗原构成。2、HLA系统血型抗原：血小板表面主要存在HLA-类抗原，
6、如HLA-A、HLA-B、HLA-C位点等,血小板特异性抗原,血小板特异性抗原(HPA)是由血小板特有的抗原决定簇组成，表现出血小板独特的遗传多态性，不存在于其它细胞和组织中，目前已发现的血小板特异性抗原已有8个系统16个抗原 国际命名原则是：在系统前冠以HPA，即人类血小板抗原的英文缩写。各抗原系统以公布日期的顺序编号。对偶抗原按人群中频率由高至 低用字母命名(例如HPA-1a,HPA-2b),血小板特异性抗原,在白种人中HPA-1b表现频率是26.5%，是引起白种人血小板输注无效发生的主要血小板特异抗原 在亚洲人中 HPA2b抗原频率约为 26，是引起亚洲人血小板输注无效发生的主要血小板特
7、异抗原。,血小板血型的临床应用,一、血小板输注无效定义：血小板输注无效-指患者输注一定量的血小板后其增加值明显低于预期值,血小板输注无效是由于患者反复输注血小板而产生了血小板同种抗体，导致再次输入血小板时，发生免疫反应。主要是由血小板HLA抗原（HLA-A，-B，-C）以及少数HPA抗原引起的，,HLA抗体在所有病人中达到50%-90%，同时，也有17%-25%的HPA抗体出现，缩短输注血小板的寿命。在黄种人中，HPA-2b是引起血小板输注无效的主要原因之一。治疗方法：输注配合的浓缩血小板。,观察血小板效果的指标,校正的血小板上升数（Corrected Count Increment,CCI）
8、血小板回收率（percentage platelet recovery,PPR）,计算公式,CCI=（输注后血小板计数-输注前血小板计数）体表面积/输注血小板总数1011PPR=（输血后血小板计数-输血前血小板计数）血容量/输入的血小板总数1011100%,诊断标准,输注血小板后1小时CCI低于7500，或24小时CCI低于4500说明血小板输注无效。（血小板计数单位为1ul,体表面积单位为M2）血小板输注后24小时回收率小于20%为血小板输注无效。（血小板计数单位为L，血容量按照75ml/kg体重计算。）,引起血小板输注无效的原因,非免疫学原因免疫学原因,非免疫学原因,脾功能亢进感染发热药物
9、作用DIC血小板的质量问题,免疫学原因,人类白细胞抗原(HLA)血小板特异性抗原(HPA)如检测到患者血清中含有HLA抗体或HPA抗体,即可判断病人的无效输注是由于同种免疫引起 的今后避免输入相应的抗原,其他临床应用,二、输血后紫癜多发生在女性，有输血和妊娠史三、新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜与新生儿溶血病的发病机制相似四、特发性血小板性紫癜,血小板血型检测技术,血小板血型（包括血小板抗原及对应抗体），在临床医学和输血实践中具有重要意义，利用可能的方法检测血小板抗体，可以提高血小板输注的安全性和有效性。,血清学检测,血小板免疫荧光试验（PIFT）：既可用于血小板抗原鉴定，又可以用于血小板抗体
10、检测和交叉试验1、血小板抗原鉴定：待测血小板用于聚甲醛（PFA）或氯喹预处理，处理过的血小板 与已知的特异性抗血清孵育，洗涤，再与标记了异硫氰酸荧光素的抗人球蛋白孵育，再次洗涤并在荧光显微镜下进行观察。,血小板抗体检测和交叉试验,利用已知抗原特异性的血小板细胞谱与待检血清混合反应，其余步骤与血小板抗原鉴定类似，最后根据血清血小板细胞谱的反应情况，来鉴定血清中抗体的特异性。,PIFT的优点,因为在显微镜下只观察荧光标记的血小板，所以可以避免由于细胞碎片等引起的非特异性反应。多特异性的抗球蛋白可以识别,流式细胞术,流式细胞术(FCM)1986年,Rosenfeld等发明了此技术。该法将待测血清和荧
11、光标记的已知型别的血小板抗体孵育后，用流式细胞仪检测。FCM用于免疫性血小板减少症患者的血小板相关抗体及血小板膜糖蛋白检测,具有灵敏、快速、简便的特点,是适用于临床诊断的新方法。,单克隆抗体免疫固定血小板抗原方法（MAIPA）：该法先制备羊抗鼠IgG包被的多孔板，另外，将鼠抗人血小板糖蛋白单克隆抗体和带有抗体的血小板共同孵育，再将孵育后的复合物加入多孔板，孵育，洗涤，最后加入酶联羊抗人抗体和酶反应底物后显色，定量测定血小板抗体。,特点,此方法敏感度高、特异性强，即使是血小板上抗原数量很少的HPA-5抗原，也能检测出。MAIPA方法可灵敏地检测血小板特异性抗体。,简易致敏红细胞血小板血清学试验（
12、SEPSA）：该法以抗人IgG抗体致敏红细胞为指示细胞，直接指示固相血小板抗原抗体免疫反应，检测血小板抗体。若血小板上存在抗体，则指示细胞呈扩散分布，为阳性；若无抗体，则指示细胞聚集在底部，呈扣状，为阴性。,特点,该方法操作简单，微量，重复性、特异性和敏感性均较理想，固相化的血小板及抗IgG指示细胞能长久保存备用，可开展大量样本的检测工作。,基因分型方法,1.聚合酶链式反应序列特异引物分型技术（PCR-SSP）的原理：设计特异性引物，利用引物3端的特异性，直接扩增相应的HPA片段，PCR产物凝胶电泳以后，以紫外线透射来检测，DNA条带的存在或缺失即可确定基因型。,特点,SSP-PCR操作比较简
13、单，耗时较少，适合小批量标本，是目前HPA基因定型中最常用的一种技术。,2.实时定量PCR,实时定量PCR原理：在PCR指数扩增期间，利用连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。这一方法成功运用于HPA-1、-2和-3基因定型。,特点,它广泛应用于定量检测mRAN表达水平，其特点是易操作、高通量、敏感性高和特异性强。,基因芯片技术（DNAmicroarray）,基因芯片技术利用正向杂交的方法，制成针对HPA基因SNP位点的DNA芯片；用荧光标记的HPA型特异性探针分别与芯片进行杂交，用软件分析样品的杂交结果，从而确定样品的HPA基因型。此技术特点是一次性可同
14、时检测大量样品，快速，准确。,限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）,原理是：限制性内切酶能够识别DNA序列上的特异性位点，并切割产生一定长度的DNA片段。相关基因片断用含SNP区域的引物进行扩增，扩增产物用一种限制性酶进行降解，酶解的PCR产物进行聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳，最后在紫外线下进行DNA片断的带型分析。,该法特点是RFLP是利用限制性内切酶酶解相应位点扩增产物，不需探针杂交，但被测的HPA基因需有合适的限制性酶切位点。,聚合酶链式反应等位基因（序列）特异性寡核苷酸杂交,（PCR-ASO）：用PCR扩增SNP的基因序列，扩增产物连接到尼龙膜支持物上，再与标记的等位基因特异性的
15、指示物-寡核苷酸探针杂交。,该方法特点是以杂交为基础的检测技术，但需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。,同源双链优先形成试验（PCR-PHFA,原理：双标记扩增产物（标准双链DNA，它的两条链分别被生物素和邻苯二甲酸二壬酯(dinonylphthalate,DNP)标记与未标记的待测DNA双链之间杂交时的竞争该,方法特点：不需要电泳，可用软件进行结果判读。,血小板抗原同种免疫的反应机制,HPA可诱导受血者体内产生一系列同种免疫反应。通常有两种反应途径：直接途径和间接途径。,直接途径,受血者CD4+T细胞上的T细胞受体直接与外源HPA同种抗原决定簇反应。供体抗原呈递细胞表面的MH
16、C类分子呈递外源HPA同种抗原决定簇。,间接途径,外源HPA同种抗原决定簇被受体抗原呈递细胞加工后，受体CD4+T细胞上的T细胞受体识别受体自身的抗原呈递细胞表面MHC类分子呈递的外源HPA同种抗原决定簇。,在这两种途径中，CD4+T细胞活化需要充分的共刺激因子。CD4+T细胞分泌的细胞因子，如白介素-2和干扰素家族，可刺激初始B细胞发育为分泌抗体的浆细胞。直接识别途径是一个强而快的反应，它可激起整个TCR受体库中5%的受体。间接识别途径中，活化的CD4+T细胞减少了约99%，但若给予与直接途径相同的滴定量，能产生等量的抗体。,血小板糖蛋白是免疫识别和免疫攻击的靶，通常被自身或同种异基因效应T细胞和B细胞所识别。在上述两种情况下，最终的反应是巨噬细胞Fc受体与免疫球蛋白分子的Fc片段结合后，血小板被巨噬细胞吞噬，这通常发生在脾中，引起血小板减少症。自身免疫的作用靶通常是非多态性的血小板糖蛋白和磷脂。同种免疫反应通常是由MHC-I类分子和糖蛋GPb/a，GPb/V/，GPa-a，GP上的同种抗原引起的，在临床上引发NAITP，PTP，PTR。,谢谢观看！,
