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1、主要内容,梅毒淋病生殖道沙眼衣原体感染生殖器疱疹,一、梅 毒,全国梅毒检测技术规范（送审稿）,3,梅毒及其病原体样品的采集和处理病原学检测血清学检测核酸检测实验室生物安全梅毒血清学检测实验室质量管理,常用梅毒检测方法,病原学检测血清学检测,病原学检查,原理：一期、二期梅毒时，取硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得到的组织液，在暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。方法：病原学检查的主要方法有暗视显微镜检查、镀银染色法和直接荧光法,病原学检查的临床意义,病原学方法直接镜检到梅毒螺旋体，在临床可确诊梅毒，且

2、具有快速、方便、易操作的特点。螺旋体检查是诊断早期现症梅毒的最佳方法，对于患者的早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源都有十分重要的意义。如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性，,梅毒血清学检测分类,(1)非梅毒螺旋体抗体检测试验（非特异性梅毒抗体）(2)梅毒螺旋体抗体检测试验（特异性梅毒抗体）两类方法。问题1：为什么梅毒实验室诊断需要两类血清学检测方法？,非梅毒螺旋体抗体检测试验,非梅毒螺旋体抗体试验原理,梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主迅速对螺旋体表面的脂质作出免应答，在3周-4周产生抗类脂抗原的抗体（反应素）。抗体主要是IgM和IgG混合抗体。未经治疗的病人，其血清内的反应素可长期存

3、在。经正规治疗后，反应素可以逐渐减少至转为阴性。问题2：临床上非梅毒螺旋体抗体试验为什么有定性和定量两种检测方法,非梅毒螺旋体抗体试验原理,所有非梅毒螺旋体血清试验的抗原基本成分都是一样方法包括：（1）快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)（2）甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）（3）性病研究实验室试验(VDRL)等。基本成分是心磷脂 卵磷脂和胆固醇抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见上述方法的敏感性和特异性都基本相似,非梅毒螺旋体抗体试验原理,VDRL试验USRRPR/TRUST,VDRL试验抗原组成：0.03%心磷脂 0.21%卵磷脂 0.90%胆固醇抗原需新鲜配制 不能保

4、存待检血清需灭活目前主要用于脑脊液检查显微镜观测结果,USR试验是VDRL试验的改良抗原组成：同VDRL，另含（1）乙二胺四醋酸(EDTA)使抗原可长期保存，能维持一年；（2）含有氯化胆碱 对血清能起到化学灭活的作用 不必加热灭活（3）制成试剂盒 使用方便,RPR试验在USR试剂成分的基础上 加入黑色碳颗粒 作为沉淀的指示物 用白色的硬纸片替代玻片血清不需要灭活不需要显微镜观测结果可作定量试验有现成的试剂盒 携带方便操作简单价格便宜,非梅毒螺旋体抗体试验原理,TRUST其原理和成分与RPR试验相同用红色的甲苯胺红替代了碳颗粒 其余的特点均与RPR相同,非梅毒螺旋体抗体试验操作要点,1、仪器：水

5、平旋转仪。,2、定性试验加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原反应：将卡片置水平旋转仪旋转8分钟，立即在亮光下观察结果,3、定量试验稀释夜准备：在圈内加入50uL生理盐水（根据需要确定稀释度），勿将盐水涂开。加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。下同定性试验。,非梅毒螺旋体抗体试验临床意义,早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后3个月，VDRL试验抗体滴度下降2个稀释度，6个月下降4个稀释度。一期梅毒1年后转为阴性 二期梅毒2年后转为阴性。晚期梅毒 治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50

6、%病人血清反应仍为阳性。,非梅毒螺旋体抗体试验临床意义,非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好。适用于大量人群的筛查。早期梅毒硬下疳出现1周-2周后，血清可呈阳性。经治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。注意：前带现象、血清固定,梅毒螺旋体抗体检测试验,梅毒螺旋体抗体试验原理,用梅毒螺旋体特异蛋为抗原，检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者终身阳性。问题3：梅毒螺旋体抗体的定量试验在梅毒诊疗中有意义吗？,梅毒螺旋体抗体试验方法,梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)梅毒螺旋体血球凝集

7、试验(TPHA)梅毒酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）化学发光试验 梅毒免疫层析法-梅毒快速检测(TP-RT)FTA-ABS 梅毒IgM抗体检测（TP-IgM）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（TP-WB）等,TPPA/TPHA原理,TPPA试验原理与TPHA试验基本相同。TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒替代TPHA试验中致敏羊红细胞，此致敏颗粒与人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应，具有较高的敏感性。明胶粒子为洋红色，在操作部步上也较为方便，出结果较快。,FTA-ABS试验原理,FTA-ABS试验是检测梅毒的“金标准”试验。其原理是将有完整形态的梅毒螺旋体作为抗原，加上经吸收剂（用

8、Reiter螺旋体制备而成）吸收过的梅毒患者血清形成抗原抗体复合物，再加入荧光素（FTIC）标记的抗人免疫球蛋白，与抗梅毒螺旋体抗体结合，形成荧光的抗原抗体复合物。在荧光显微镜下，螺旋体显出苹果绿色的荧光，即为阳性反应。,TPELIS试验原理,TPELIS试验是用重组梅毒螺旋体抗原包被固相板条，加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物，形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶联检测仪判定试验阳性反应。本法可用于大规模血清检测。,梅毒免疫层析快速检测方法,梅毒螺旋体抗体试验临床意义,作为非梅毒螺旋体抗原血清试验(如RPR等)初筛阳性标本的确证试验。梅毒患者经过抗梅治疗后，TPPA等梅毒螺旋体抗体试验试验仍

9、可阳性，故TPPA等试验阳性不能作为疗效观察的指标。TPPA等阳性不能区分既往感染和现症感染，应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果进行诊断。,非梅毒螺旋体抗体试验结果解释示意图,早期,晚期,一期,二期,早期潜伏,晚期潜伏,三期,治疗前 治疗后,阳性,阴性,梅毒螺旋体抗体试验结果解释示意图,早期,一期,二期,早期潜伏,晚期,晚期潜伏,三期,治疗前 治疗后,阳性,阴性,梅毒血清学试验结果的临床意义总汇,USR TPPA RPR TP-ELISA 临床意义 VDRL TP-RT _ _ 排除梅毒（一期梅毒的早期）+现症梅毒(梅毒孕妇所生的婴儿除外)+-生物学假阳性-+早期梅毒经治疗后（早早期梅毒）,梅

10、毒血清学检测目的,临床诊断、血液筛查、流行病学监测以临床诊断为目的的检测是为了确定梅毒感染的状况。以血液筛查为目的的检测是为了防止梅毒的经血传播。以流行病学监测为目的的检测是为了调查梅毒血清学感染率和发病率。,梅毒血清学检测检测策略及要求,检测策略以临床诊断为目的两种策略 以血液筛查为目的的检测策略 以流行病学监测为目的的三种检测策略检测要点根据目的选择检测方法及检测策略。可采用任何一类梅毒血清学检测方法作为筛查试验。检测试剂要求所有应用于临床的检测试剂均必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂，有批批检合格证的试剂。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。,以临床诊断为目

11、的的检测策略一,以临床诊断为目的的检测策略二,以血液筛查为目的的检测策略,附1：2009年度梅毒血清学检测试剂评估结果,2009年参评试剂厂家(非梅毒螺旋体抗原血清学试验),试剂名称 生产厂家(试剂简称)批号 有效期梅毒快速血浆反应素环状卡片 上海科华生物技术有限 20090901 20100906试验诊断试剂盒(RPR)公司(科华RPR)梅毒甲苯胺红不加热血清试验 上海荣盛生物技术有限 20090901 20100903诊断试剂盒(TRUST)公司(荣盛TRUST)梅毒甲苯胺红不加热血清试验 北京金豪制药有限公司 200909098 20100704 诊断试剂盒(TRUST)(金豪TRUST

12、)梅毒甲苯胺红不加热血清试验 北京万泰生物药业有限 M20090803 20100806诊断试剂盒(TRUST)公司(万泰TRUST)梅毒甲苯胺红不加热血清试验 英科新创(厦门)科技有限 2009057602 20100521诊断试剂盒(TRUST)公司(英科TRUST)梅毒甲苯胺红不加热血清试验 郑州安图绿科生物工程 20090818 20100817 诊断试剂盒(TRUST)有限公司(安图TRUST),参评试剂厂家(梅毒螺旋体抗原血清学试验),试剂名称 生产厂家(试剂简称)批号 有效期 梅毒螺旋体抗体诊断试剂(双抗 上海科华生物技术有限公司 20090517 20100515夹心法)(EL

13、ISA-TP)(科华ELISA)梅毒螺旋体抗体胶体金诊断 艾康生物技术(杭州)有限公 200911208 09-2011试剂(TP-RT)司(艾康RT)梅毒螺旋体抗体酶联免疫诊断试剂 北京华大吉比爱生物技术有 20091005 2010.10.05盒(双抗原夹心法)(ELISA-TP)限公司(华大ELISA)梅毒螺旋体抗体诊断试剂(双抗 北京金豪制药有限公司 200909105 2010/09/09夹心法)(ELISA-TP)(金豪ELISA)梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒(化学 北京科美东雅生物技术有限 20091026 20101025发光法)公司(科美发光)梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒(酶联 北京

14、现代高达生物技术有限 200908003 20100817免疫法)(ELISA-TP)责任公司(现代ELISA)梅毒螺旋体抗体诊断试剂(双抗 北京万泰生物药业有限 N20090302 20100304夹心法)(ELISA-TP)公司(万泰ELISA)梅毒螺旋体抗体诊断试纸盒 北京万泰生物药业有限公司 O20090903 2011-02-07(TP-RT)(万泰RT)梅毒螺旋体抗体酶联免疫诊断试盒剂 英科新创(厦门)科技有限公司 2009097513 20100903(双抗原夹心酶联免疫法)(ELISA-TP)(厦门英科新创ELISA)梅毒螺旋体抗体检测试纸条(胶体金)英科新创(厦门)科技有限公

15、司 2009040919 20101024(TP-RT)(厦门英科RT)梅毒螺旋体抗体诊断试剂(双抗夹心 珠海丽珠试剂有限公司 20090702 20100701法)(ELISA-TP)(丽珠ELISA),结 果(非梅毒螺旋体抗原血清学试验),试剂简称 敏感性(%)特异性(%)Kappa值 金豪TRUST 96.2 94.9 0.899 荣盛TRUST 94.3 96.9 0.912新创TRUST 92.5 95.9 0.883 安图TRUST 92.5 95.4 0.876 万泰TRUST 91.5 95.9 0.876,结 果(梅毒螺旋体抗原血清学试验),试剂简称 敏感性(%)特异性(%)

16、功效率(%)Kappa值科美发光 100.0 100.0 100.0 1.000 万泰ELISA 100.0 100.0 100.0 1.000 新创ELISA 97.6 100.0 99.0 0.979 丽珠ELISA 96.7 100.0 98.7 0.972 华大ELISA 96.7 100.0 98.7 0.972 科华ELISA 100.0 98.9 99.3 0.986 现代ELISA 100.0 98.3 99.0 0.979 金豪ELISA 99.2 98.3 98.7 0.972 万泰RT 100.0 99.4 99.7 0.993 英科RT 96.7 99.4 98.3 0

17、.965 艾康RT 91.1 99.4 96.0 0.916,附2：梅毒检测实验室设置的要求（供讨论）,梅毒检测实验室的设置要求,各省（自治区、直辖市）梅毒检测实验室设置根据职能及承担的梅毒检测任务分为三级实验室，即确证中心实验室、确证实验室、筛查实验室，省级卫生行政部门负责组织专家组对各级梅毒检测实验室技术和条件进行考核验收。在具备HIV等血清学检测实验室的机构，可与其共享空间和设备,：梅毒筛查实验室：能够至少开展一种简单、方便、快速的梅毒血清学检测方法，如快速胶体金试验、ELISA等梅毒螺旋体抗体检测方法，或RPR、TRUST等非梅毒螺旋体抗体检测方法。所有的医疗卫生机构均应能够开展梅毒筛

18、查试验。梅毒确证实验室：能够同时开展梅毒螺旋体抗体和非梅毒螺旋体抗体这两类梅毒血清学检测方法。每一个县区至少有一个梅毒确证实验室，负责对筛查实验室转诊病人进行确证检测。梅毒确证中心实验室：能够开展各类梅毒实验室检测方法、以及多种梅毒螺旋体抗体和非梅毒螺旋体抗体血清学检测方法，包括梅毒螺旋体镜检、VDRL、IgM抗体检测等方法。能够对特殊疑难病人进行鉴别和确证，各省应至少建立一个梅毒确证中心实验室。,梅毒筛查实验室,能够至少开展一种简单、方便、快速的梅毒血清学检测方法，如快速胶体金试验、ELISA等梅毒螺旋体抗体检测方法，或RPR、TRUST等非梅毒螺旋体抗体检测方法。所有的医疗卫生机构均应能够

19、开展梅毒筛查试验。,梅毒确证实验室,能够同时开展梅毒螺旋体抗体和非梅毒螺旋体抗体这两类梅毒血清学检测方法。每一个县区至少有一个梅毒确证实验室，负责对筛查实验室转诊病人进行确证检测。,梅毒确证中心实验室,能够开展各类梅毒实验室检测方法、以及多种梅毒螺旋体抗体和非梅毒螺旋体抗体血清学检测方法，包括梅毒螺旋体镜检、VDRL、IgM抗体检测等方法。能够对特殊疑难病人进行鉴别和确证，各省应至少建立一个梅毒确证中心实验室。,二、淋 病,常用淋病检测方法,直接显微镜检查分离培养淋球菌,直接显微镜检查,原理：男性淋菌性尿道炎患者常有大量黄白色脓性分泌物，其多形核白细胞内可找到革兰染色阴性的双球菌。方法：革兰染

20、色为一传统方法，革兰染色将菌分为二大类，即染成紫色的革兰阳性菌及染成红色的革兰阴性菌。,直接显微镜检查的临床意义,男性淋菌性尿道炎的尿道标本 敏感性及特异性可高达95%99%，具诊断价值。宫颈标本、无症状男性尿拭子及取自直肠的涂片时 敏感性仅4070%。不推荐直接显微镜检查诊断直肠和咽部淋球菌感染。亦不能用于疗后判愈。如果在多形核细胞外见到形态典型的革兰阴性双球菌，需做培养进行确证。,淋球菌培养,1原理：淋球菌在适宜的培养基上可生长出特征性的菌落，根据菌落大小、形态、光泽、边缘、颜色等情况，可以作为淋球菌的鉴定依据之一。2、方法特点：敏感性 81100%。特异性 100%,淋球菌培养,培养条件

21、：35 36，含5%10%CO2，湿润（70%湿度）的环境。CO2环境可由CO2培养箱、CO2产气袋及烛缸提供。使用烛缸时，应使用白色、无芳香味的无毒性蜡烛。在烛缸底部放些浸水棉球以保持一定的湿度。培养时间：2448小时,淋球菌的初步鉴定,初步鉴定淋球菌的依据菌落特征氧化酶试验革兰染色,淋球菌培养的临床意义,培养法为诊断淋病的金标准.用于女性感染者、亚临床感染者、以及来自直肠和咽部的感染的确诊试验。,生殖道沙眼衣原体感染,生殖道沙眼衣原体感染简介,50年代,80年代,梅毒淋病软下疳性病性淋巴肉芽肿,梅毒淋病软下疳性病性淋巴肉芽肿非淋菌性尿道炎生殖器疱疹尖锐湿疣HIV/AIDS,2007年后,梅

22、毒淋病生殖道沙眼衣原体感染生殖器疱疹尖锐湿疣HIV/AIDS,常用生殖道衣原体感染检测方法,抗原检测 酶联免疫吸附试验（ELISA）免疫层析快速检测核酸检测,酶联免疫吸附试验,1、原理：于衣原体特异性单克隆抗体形成抗原抗体复合物，通过酶联显色反应检测衣原体抗原。2、方法特点 敏感性：7997 特异性:9799试验结果阴性时，不能完全排除沙眼衣原体感染，有可能是沙眼衣原体数量不足或标本采集不当的缘故,结果判读客观性强，适宜于大样本沙眼衣原体感染的检测。在沙眼衣原体高流行率的人群临床和健康体检；低流行率（小于5%）的人群中应用时，结果解释应慎重。,酶联免疫吸附试验临床意义,抗原快速检测,1、原理：

23、利用免疫层析法原理，采用胶体金标记的沙眼衣原体抗体滤纸条或卡，快速检测标本中的沙眼衣原体抗原。2、方法特点简易，方便，快速，尤其适用于基层单位标本中需要足够数量的沙眼衣原体抗原，否则有假阴性结果,抗原快速检测临床意义,该方法主要适用于女性患者宫颈标本的检测，敏感性较低。该法快速、简便，无需特殊仪器，因此，较适合基层实验室开展。,核酸扩增检测,1、原理：核酸扩增技术是通过扩增沙眼衣原体的多拷贝基因（如隐蔽性质粒、染色体和RNA）检测病原体。2、方法包括聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、等温链置换扩增技术（SDA）、转录介导扩增技术（TMA）等。目前国内广泛使用的有实时荧光PCR。,

24、核酸扩增检测临床意义,核酸扩增检测具有很高的敏感性和特异性，世界卫生组织已推荐为扩大的生殖道沙眼衣原体感染实验室诊断的“金标准”。核酸扩增检测不仅可用于宫颈、尿道标本中沙眼衣原体的检测，也可用于男女性尿液标本的检测。开展核酸检测的实验室应通过有关部门考核取得开展临床核酸检测技术资格证。,方法评价,核酸检测 是目前为止最好的检测方法但存在检测敏感性 上的局限性ELISA抗原检测 严格按操作说明进行操作是非常好的检测方法 高通量，自动化快速抗原检测 操作时间短，单人份操作，但敏感性极低,生殖器疱疹,常用生殖器疱疹检测方法,抗原检测抗体检测,抗原检测,1、原理：将HSV特异性单克隆抗体包被在酶标板微

25、孔壁上，捕获标本中的HSV抗原，形成抗原抗体复合物，继而与酶标记的二抗结合，通过酶联显色反应检测HSV。2、方法：ELISA为目前临床上HSV抗原检测的常用方法之一,抗原检测临床意义,生殖器疱疹感染的临床表现变化多样，临床诊断的准确性不足50%70%，通过实验室检测手段可确证HSV感染,抗体检测,原理：将HSV特异性抗原包被在酶标板微孔底上，捕获标本中的HSV抗体，形成抗原抗体复合物，通过酶联显色反应检测HSV抗体。方法：有检测IgG 和IgM 两种ELISA方法,抗体检测临床意义,检测抗HSV抗体的血清学试验可用于证实既往HSV感染、回顾性诊断原发性感染，对恢复期或复发性生殖器疱疹的诊断意义不大。HSV型特异性血清学抗体检测是发现亚临床无症状生殖器HSV感染者的手段之一。,谢 谢!,