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1、热烈欢迎农业部领导和各地检测机构同仁的光临！,农业行业标准饲料中三聚氰胺的测定,国家饲料质量监督检验中心（北京）,一、目的、意义,三聚氰胺简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺，英文名：Melamine,分子式：C3N6H6是一种用途广泛的具有均匀结构的有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺-甲醛树脂（MF）的原料,逐步拓展到胶粘剂、减水剂、交联剂、阻燃剂、印染及造纸助剂等各个领域。以上的三聚氰胺用于制作树脂（三聚氰胺与甲醛合成的树脂），该树脂为热固性树脂，它具有阻燃，耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀、有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度，广泛用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织
2、、皮革、电气、医药等行业。,其余的以晶体粉末和盐的形式用于生产阻燃剂。三聚氰胺甲醛树脂以其良好的耐热、耐沸水、耐老化、高光泽、易配色、高硬度介电不易燃、防酸碱、无毒等特性，广泛应用于餐具、家具、装饰板、油漆、油墨、涂料、印染、织物防皱防缩处理、造纸、塑料制品及电器部件等近年来三聚氰胺在高级轿车用漆、金属薄板用彩色涂料、皮革鞣制、地毯阻燃、装饰板材料的防水粘接剂、水泥预制构件用减水早强剂等方面的应用中均得到广泛开发,三聚氰胺的结构,结构式,理化性质,物理性能：白色结晶粉末，无毒，无味，相对密度：1570kg/m 熔点：在常压下，354分解，升华温度：300。溶解性：能溶于甲醛、乙酸、热乙二醇、甘
3、油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳。水溶液呈弱碱性。化学性能：三聚氰胺显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐。在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物。其中三聚氰胺与甲醛水溶液的反应是最重要的,目的、意义,最近，在美国发现某些宠物食品含有三聚氰胺，并有因此造成宠物死亡的报道，经调查发现，是由于宠物食品中添加的某些植物蛋白粉中非法添加了三聚氰胺。不法厂商在植物蛋白粉中添加三聚氰胺一是三聚氰胺物理性状为“白色单斜晶体、无味”，这与蛋白粉相仿。而且此物质易于购买，也易于生产，成本很低。在蛋
4、白粉中添加三聚氰胺，一方面可增加非蛋白氮的含量，另一方面又可以增加粘度。精细有机化工原料及中间体手册显示，三聚氰胺“本品低毒，无刺激性高温下可能分解产生氰化物（有较大毒性），故应避免高温”。,目的、意义,由国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的国际化学品安全手册（第三卷），对三聚氰胺则有如下描述：“长期或反复接触作用：该物质可能对肾发生作用”。要禁止三聚氰胺在饲料中的非法添加，就必须对饲料行业进行严格管理和专项治理，只有制定相应的测定方法，才能有效地进行管理因此，制定一个简便、快速、准确的测定饲料中三聚氰胺的方法对规范饲料中三聚氰胺的使用，加强饲料的检测监督，保障国民健康，扩大对外贸易，具
5、有十分重要的意义。,国内外方法研究概况与研制的基本思路,三聚氰胺(蜜胺)的测定,目前还没有官方方法和标准 美国FDA在三聚氰胺事件中的检测采用了实验室方法。此方法分为两种方法，为高效液相色谱法和气相色谱质谱法。它的气相色谱质谱法由于提取不完全，无法准确定量，因此，只作为筛选法。而它的高效液相色谱法由于没有净化过程，对于基质复杂的饲料中三聚氰胺的测定效果不理想,国内外方法研究概况与研制的基本思路,中国检科院的实验室方法的检测方法为高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法，其液相色谱法使用己烷磺酸钠为离子对试剂，色谱柱采用C18柱，而液相色谱串联质谱法则采用乙腈溶液直接提取上机测定。由于采用己烷磺酸钠为
6、离子对试剂和使用C18柱在检测配合饲料和宠物食品等复杂基质的样品时，三聚氰胺的保留还不够，容易产生干扰 而液相色谱串联质谱法则采用乙腈溶液直接提取上机测定，易造成色谱柱的损坏，还会造成质谱仪的污染，而且样品的基质干扰严重，必须采用基质稀释。,国内外方法研究概况与研制的基本思路,我们参照美国FDA和国内中国检科院的实验室方法，研究确定了经过净化的高效液相色谱法和气相色谱质谱法，经过净化的方法可有效测定复杂基质中三聚氰胺的含量，而气相色谱质谱法由于使用毛细管柱，分离效率高，经衍生后定性更加准确，方法灵敏度高，定量准确，适用范围扩大为各种饲料，可有效的测定饲料中三聚氰胺。,重要测定条件与实验参数的研
7、究确定,提取条件的确定 净化条件的选择 三聚氰胺的衍生化 仪器条件的选择 方法的性能检验 实际样品的检测,提取条件的确定,美国FDA实验室方法，气相色谱质谱法采用甲醇提取，由于三聚氰胺在甲醇中溶解度很低，因此，FDA只将其作为定性筛选法，而其高效液相色谱法由于没有净化过程，对于基质复杂的饲料中三聚氰胺的测定效果不理想。我们主要采用中国检科院的提取净化方法 主要改进在于提取时加入乙酸铅溶液去除蛋白，而对于脂肪含量较高的宠物食品(罐头)由于三聚氰胺在乙醚中不溶，采用乙醚脱脂后提取，获得了满意的结果，而且提取方法简单，而对于宠物食品（干粮），称取在索式提取器中用乙醚回流6h去除脂肪，由于温度高、时间
8、长，回收率只有40-60%，而直接用1的三氯乙酸溶液提取，回收率高于80%。,提取条件的确定,本方法确定的提取条件 植物蛋白、饲料和宠物饲料（干粮）中三聚氰胺的提取：称取5g样品（精确至0.01g），准确加入50mL1的三氯乙酸溶液，准确加入2mL饱和醋酸铅溶液。摇匀，超声提取20min。静止2min，取提取液约30mL转入离心管，在10000rpm离心机上离心5min。宠物饲料（罐头）：称取5g样品（精确至0.01g），加入50mL乙醚，摇床上120转/分震荡1小时，弃去乙醚，再加入50mL乙醚，摇床上120转/分震荡1小时，弃去乙醚，其余步骤同上。,净化条件的选择,我们主要采用中国检科院的
9、提取净化方法，使用了不同的净化柱试验了样品的净化效果。我们对比了OASIS MCX柱、PCX和LC18等几种固相萃取柱，结果LC18由于三聚氰胺难以保留，样品添加没有回收。只有OASIS MCX和PCX柱达到了良好的回收，回收率大于80%。我们确定的净化条件为：固相萃取柱活化和上样：分别用3ml甲醇，3ml水活化柱，准确移取10mL离心液分次上柱。再用3ml水和3ml甲醇洗涤固相萃取柱柱，抽近干后用5氨水甲醇溶液（4.5）3ml洗脱。洗脱液于氮吹仪上50氮吹至干，用2+8甲醇水定容，过0.45m滤膜，滤液用于液相色谱测定。,仪器条件的选择,HPLC条件的优化,HPLC条件的优化,流动相和色谱柱
10、的选择 检测波长的选择,流动相和色谱柱的选择,根据有关文献，我们分别采用乙腈：（10mM庚烷磺酸钠，10mM柠檬酸缓冲液）10：90、乙腈：10mM庚烷磺酸钠，10mM柠檬酸缓冲液8：92以及乙腈：（10mM辛烷磺酸钠，10mM柠檬酸缓冲液）10：90进行了实验，我们发现采用C8的柱子，使用乙腈：（10mM庚烷磺酸钠，10mM柠檬酸缓冲液）10：90 可以达到使用C18乙腈：（10mM辛烷磺酸钠，10mM柠檬酸缓冲液）10：90的保留水平，因此，6min左右的保留时间既能有效的分析杂质，又能够提高分析效率，因此，我们选用C8色谱柱，流动相采用乙腈：（10mM辛烷磺酸钠，10mM柠檬酸缓冲液）1
11、0：90，得到了满意的结果。,检测波长的选择,将10g/mL的三聚氰胺标准液进样，在二极管阵列检测器上扫描，波长从200nm至400nm，见图1，结果显示三聚氰胺在236nm处有最大吸收，各种文献均采用240 nm为分析波长，因此选定240nm为检测波长。,方法的性能检验,HPLC方法性能检验,HPLC方法性能检验,标准品的线性范围 最低检测浓度 仪器的精密度 方法的准确度、精密度和适用范围 方法干扰试验,标准品的线性范围,准确移取三聚氰胺标准储备液，用提取液依次稀释，配制成浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0g/mL的标准溶液，根据三聚氰胺的浓度和峰面积的关系
12、，绘制线性关系曲线（见图2）。,标准品的线性范围,最低检测浓度,在实际饲料样品（鸡配合饲料、预混合饲料、玉米蛋白、宠物干粮）中添加三聚氰胺标准工作液，经提取、净化、过滤，以大于10倍噪音量的信号为准，取样为5g时，最小定量检出限2.0mg/Kg，回收率大于70%。,仪器的精密度,以10g/mL的三聚氰胺标准工作液，重复进样8次，计算峰面积的变异系数，结果见表1，结果表明在此色谱条件下，仪器处于良好的分析状态。,方法的准确度、精密度和适用范围,为考察方法的准确度、精密度和适用范围，我们在不同的饲料中添加不同浓度的三聚氰胺，测得的添加回收率和结果的变异系数列于表2、表3、表4、表5、表6。,表2
13、猪配合饲料添加试验,表3 鸡配合饲料添加试验,表4 猪预混合饲料添加试验,表5 牛浓缩饲料添加试验,表6 大米蛋白粉添加试验,表7 犬粮添加试验,表8 宠物罐头添加试验,从表中数据可以看出，本方法具有较高的回收率和较好的精密度(均大于85%)，而且能适应配合饲料、预混合饲料、浓缩料、宠物食品和植物蛋白饲料等各种饲料中三聚氰胺的测定，而且浓度从10mg/Kg到1000 mg/Kg都有较高的回收率。,方法干扰试验,考虑到一些相关物质也可能存在于饲料中，它们是否会对饲料中三聚氰胺测定造成干扰，因此，对一些可能产生干扰的物质进行了干扰试验。采用本方法的色谱条件，使用本标准的上机溶剂，试验了羟乙基纤维素
14、、聚羟甲基脲、硫脲、脲、三聚氰酸、维生素B1、维生素B6、烟酸、烟酰胺、叶酸等物质的保留特性，以上物质均不在三聚氰胺的保留时间附近出峰，因此，对饲料中三聚氰胺测定不会造成干扰,羟乙基纤维素,聚羟甲基脲,硫脲,脲,三聚氰酸,图3 10g/mL三聚氰胺标样色谱图（6.572min的峰为三聚氰胺）,图4 猫罐头空白和20mg/Kg添加图谱,图5 预混料空白和20mg/Kg添加图谱,玉米蛋白阳性样品谱图,饲料阳性样品色谱图,实际样品的检测,到目前为止，共检测各种实际样品七百多个，平行样品具有良好的平行性，液相色谱法与气相色谱质谱法符合率大于96%，液相色谱法定性准确性也很好。,验证情况,农业部饲料工业中心中国农业科学院饲料研究所农业部饲料质量监督检验测试中心（济南）验证结果与我们的结果完全符合,结 论,本方法具有很好的准确度和精密度，并能适合配合饲料、预混合饲料、浓缩料、宠物食品和植物蛋白饲料等各种饲料中三聚氰胺的测定，而且操作简便、耗时短，具有定量方法和确证方法，具有很高的灵敏度，线性范围宽，回收率高，是一种简单、快速、准确的分析方法。,谢谢大家！,
