6-沉淀反应.ppt

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1、第五章 沉淀反应,第一节 液相沉淀试验（fluid phase precipitation)第二节 凝胶沉淀试验(gel phase precipitation)第三节 免疫电泳技术（immunoelectrophoresis）第四节 免疫浊度测定,沉淀反应:(precipitation)可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下 发生结合，出现肉眼可见的沉淀现象。,概 念,沉淀反应中:可溶性抗原-沉淀原;抗体-沉淀素出现可见反应的时间长,易受多种因素影响一般选用多克隆抗体;易出现可见反应对抗原抗体的比例要求高-选用R型抗体;常将抗原作不同程度的稀释,凝集反应和沉淀反应的不同点,免疫电泳免疫浊度,沉淀

2、反应的类型:,液相内沉淀试验：指抗原抗体在以生理盐水 或其它无机盐缓冲液为反应介质的液相内 自由接触，短时间可出现反应。,凝胶内沉淀试验：指琼脂糖内扩散或凝胶内 扩散试验。出现可见反应时间较长。,第一节 液相沉淀试验,一、絮状沉淀试验:(flocculation test)二、环状沉淀试验:(ring precipitation test),原理,一、絮状沉淀试验(flocculation test),抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质存在下，抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。,操作步骤,方法评价：敏感度较低、简便、易受抗原抗体比例 影响-最适比,临床意义：测定抗原抗体反应 的最适比。,1:

3、2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,各管抗原倍比稀释,加入抗血清,各管抗体量不变,振摇 混匀、37孵育,沉淀量不同,出现沉淀量最多的管为最适比例管。,轻摇,絮状沉淀试验,絮,状,沉,示,意,图,淀,Ag,AbAg,原理,二、环状沉淀试验,把抗原液小心地加于已含抗体液的细试管液面上，当对应的抗原与抗体相遇，在界面处形成清晰的乳白色沉淀环。,(ring precipitation test),方法评价：敏感度较低、简便、快速、实用、只能 定性不能定量、缺 乏多对分辨力。,临床意义：鉴定血迹、诊断炭疽,Ab,Ag,环状沉淀示意图,环状沉淀示意图,沉淀管内径1.52mm15m

4、in出现沉淀环为阳性30min不出现沉淀环为阴性,操作步骤,第二节 凝胶内沉淀试验,原理：可溶性Ag和相应Ab在凝胶中扩散，形成 浓度梯度，在Ag与Ab浓度比例适当的位 置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。常用凝胶：琼脂(糖)。琼脂(糖)：加热至100时融化，冷却至45时 重新凝固。适宜浓度的凝胶可视为固相的液体，水分占98%以上。,凝胶的特点：凝胶呈网络状结构，可将水分固相化。Ag、Ab在凝胶中可自由扩散。扩散速度与分子大小相关：小分子，扩散快；大分子，扩散慢。可利用此点来识别待测物分子量的差别。Ag-Ab复合物分子量超过百万，被固定在凝胶中相应位置。,凝胶内沉淀试验的类型：1、单向琼脂扩散试验

5、：原理：凝胶中含一定量抗体,加入抗原,抗原 在琼脂内自由扩散，在一定区域内形成 可见的沉淀线/环,常用于抗原定量分析。2、双向琼脂扩散试验：原理：琼脂内抗原、抗体各自向对方扩散，在最适当的比例处形成抗原抗体沉淀 线。常用于抗原、抗体定性分析。,原理,一、单向琼脂扩散试验,将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由扩散，与相应抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。,操作步骤,(single gel diffusion test),方法评价：敏感度1.25mg/L、稳 定、简便、重复性和 线性均好,影响因素：,示意图,（沉淀环直径)2,抗原浓度,1.抗体混于凝胶中2.抗原加入

6、孔内3.抗原自由扩散,标准品抗原浓度测定,不同病人抗原浓度测定,1.测定沉淀环直径2.在标准曲线上查找 相应抗原浓度,单向琼脂扩散试验抗原含量的计算方法：,1、ancini曲线：适用范围：Ag为大分子,扩散时间(48h),用方格纸画曲线。计算公式：c=kd2。2、ehey曲线：适用范围：Ag为小分子，扩散时间短(24h)。用半对数坐标纸画线。计算公式：logc=kd。,对待检蛋白质样品定量测定的条件：1、具有单价特异性抗血清2、已知含量标准品（绘制标准曲线用）3、待检含量1.25ug/ml。（敏感度稍低）单扩试验的应用范围：常用于Ig、Ig、IgM、C3、C4等测定，简易的抗原定量技术。,影响

7、因素,1.抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关,6.琼脂板厚度：与沉淀环反相关,2.抗体种类：兔抗血清优于马、羊,3.抗体稀释度：抗体浓度大沉淀环小,4.扩散时间：抗原含量高，扩散时间长,5.扩散温度：437内温度与扩散速度正相关,原理,二、双向琼脂扩散试验,将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成沉淀线。,操作步骤,(double gel diffusion test),应用：1.检测未知Ag或Ab2.Ag性质分析3.Ab效价滴定4.Ag或Ab纯度鉴定,原理示意图,Ab,Ag,模拟图,染色标本图,1.抗原抗体双向自由扩散2

8、.24小时出结果3.呈现沉淀线或弧,1.检测未知抗原或抗体估算Ag、Ab的相对含量（沉淀线的位置）沉淀线靠近相对含量较低的一方估算Ag、Ab的相对分子量（沉淀线的形状）沉淀线弧线弯向相对分子量较大的一方2.抗原性质分析（两种受检Ag的性质是否相同）沉淀线完全吻合：两种抗原完全相同沉淀线部分吻合：两种抗原有相关成分沉淀线交叉：两种抗原完全不同3.抗体效价滴定4.抗原或抗体纯度鉴定,双向琼扩散试验的应用,应用,1.检测未知抗原或抗体,Ag,Ab,A B C D E F,A:浓度Ag、Ab及分子量近似；,B：浓度Ag、Ab近似，分子量AgAb；,C：浓度Ag、Ab近似，分子量AgAb；,D：浓度Ag

9、Ab，分子量近似；,E：浓度AgAb，分子量AgAb；,F：浓度AgAb，分子量AgAb；,检测未知抗原或抗体,2.抗原性质分析,2表示标准Ag,1表示待检Ag,待检Ag与标准抗原完全相同；,待检Ag中含有与标准Ag相同的Ag；还有另外的Ag与Ab相对应；部分相同,待检Ag有与Ab相对应的Ag，但与标准Ag不同；完全不同,待检Ag与标准Ag性质相同；但含量较低；,抗原性质分析,g性质的分析（三角形孔）,3.抗体效价滴定,1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。,2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。,3.可进行任意稀释。,抗体效价滴定,4.抗原抗体纯度鉴定,“1”为单一抗原抗体系统

10、。,“n”为多个抗原抗体系统。,*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。,抗原抗体纯度鉴定,*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。,第三节 免疫电泳技术（immunoelectrophoresis）,免疫电泳技术：在直流电场作用下的固 相内或表面的扩散试验。,基本原理：电泳技术+沉淀反应,优点：加快沉淀反应的速度；提高灵敏度。,应用：主要用于细微成分的分析。,电泳原理：带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动。,在常规血清蛋白电泳，一般选择可使所有蛋白质分子均带负电荷的碱性缓冲液。,电场中的作用力（碱性条件下）电泳力：蛋白质由阴极向阳极移动。电渗力：水分子向阴极移动。若电泳力电渗力,向阳极移动(大多数Ag)电渗

11、力电泳力,向阴极移动（b）。,电泳载体：0.81.0%琼脂糖。,电泳原理,pH 88.6 缓冲液中,阴粒离子多,等电点pH34分子量较小,等电点pH56分子量较大,阴粒离子少,向正极电泳力小,向正极电泳力大,电渗作用,带负电的琼脂,静电感应,液体流向负极,电渗力,影响因素,影响因素,1.电场强度：恒定电流24mA/cm,电压210V/cm,4.电渗：在电场中液体相对于固体的移动。,2.溶液pH值：缓冲液偏碱性，蛋白质带负电荷,3.离子强度：高，质点泳动慢，热效应较高,原理,一、对流免疫电泳(CIEP),在直流电场中进行的免疫双扩散技术。,操作步骤,(counter immunoelectrop

12、horesis),概念,电泳力使质子向正极，电渗力使质子向负极，质子泳动的方向取决于二者力量的对比。,方法评价：简便、快速、敏感度较双扩高、分辨力较双扩低。,示意图,不适宜抗原抗体都是球蛋白的检测IgG1和IgG2：向负极泳动IgG3和IgG4：向正极泳动,示意图,I=34mA/cm,+,1：Ag与Ab对应；,2：AbAg，Ag为 弱阳性,3：AgAb，Ag强阳性,4：AgAb，Ag含量较高；,对流免疫电泳,-,对流免疫电泳,结果：gAb在比例合适处形成沉淀线。,原理 单扩电泳,二、火箭免疫电泳(RIE),把抗原放在含有抗体的凝胶内电泳，其沉淀形似火箭。,操作步骤,(rocket immuno

13、electrophoresis),概念,待测Ag在含适量Ab的琼脂板中泳动时，Ag与Ab达到适当比例形成大的不溶性IC而不再移动，未与Ab结合的Ag可继续向前泳动，并形成新的沉淀，随着Ag的减少，沉淀带越来越窄，形似火箭峰状。,方法评价：简便、快速、敏感度高，测0.3mg/L、重复性好,1.抗体混于凝胶中2.抗原加入孔内3.抗原定向向正 极泳动4.形成沉淀峰,示意图,+,68mm,5mm,火箭免疫电泳,沉淀峰高,抗原浓度,1.测定沉淀峰高度2.在标准曲线上查找 相应抗原浓度,绘制标准曲线,染色标本结果,标准曲线,注意事项,2.琼脂应为无电渗或电渗很小,1.电泳顶部云雾状或 圆形，应继续电泳,3

14、.标本 多时，应将琼 脂板置于电泳槽 上，搭桥并开启 电源后加样，否则 形成宽底。,4.IgG在pH8.6的 缓冲条件下净 电荷为零，因 此需经甲醛 化处理,注意事项,原理,三、免疫电泳(IEP),将区带电泳和双扩结合的一种免疫化学分子技术。,操作步骤,(immunoelectrophoresis),概念,先将待检标本进行区带电泳，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入含相应Ab的血清，与已分离的Ag在琼脂内作双扩，各区带在相应位置与Ab形成沉淀弧。,方法评价：,临床意义：用于正常情况、免疫后以及病理过程中血清蛋白分析。,示意图,1、2孔分别加Ag，I=34mA/cm，电泳2h，分离Ag。,打槽，槽

15、内加入已知混合抗血清，双方自由扩散。,观察沉淀线的数目、形状、位置。,免疫电泳,1,2,IgG 型,四、其它免疫电泳技术,免疫固定电泳(immunofixation electrophoresis)免疫选择电泳(immunochoose electrophoresis),原理,（一）免疫固定电泳(IFE),(immunofixation electrophoresis),将区带电泳和沉淀反应相结合的一种技术。,鉴定具有近似迁 移率的各种蛋白（如McAb的轻链、补体裂解产物、触珠蛋白的遗传 型、游离轻链）,方法评价,操作简便，结果清晰，快速（3h）检测单一成分的敏感度高于IEP,临床意义,免疫固

16、定电泳,方法：待检蛋白电泳贴浸有抗血清的滤纸 抗原与对应抗体反应沉淀漂洗染色某一抗原的存在?,示意图,免疫固定电泳,-,+,抗正常人全血清,抗IgG,抗IgM,抗IgA,抗,抗,孵育,Ag-Ab沉淀,洗涤、干燥,染色,结果,原理,（二）免疫选择电泳(ICE),(immunochoose electrophoresis),火箭电泳和双扩相结合的一种分析技术。,用于经IEP和IFE不能解释的一些McAb或寡克隆蛋白的测定。,方法评价,操作复杂，不适合常规应用。必须具有各种纯度高、亲和力强、高质量的抗血清用于对未知抗原的测定。,临床意义,C IgA骨髓瘤,孔中为血清标本，槽中为抗IgA重链抗血清,1

17、.在琼脂凝胶中混入 或轻链抗体；2.孔中加入待检血清；3.进行火箭电泳。4.槽内加入某类抗Ig；5.进行双扩；6.观察结果。,A.正常人,B.重链病,免疫选择电泳,第四节 免疫浊度测定,抗原抗体复合物能引起液体介质浊度改变-免疫浊度测定1.透射比浊法（transmission turbidimetry)2.散射比浊法（nephelometry)速率散射比浊法(rate nephelometry)终点散射比浊法(endpoint nephelometry)3.免疫胶乳比浊法(immunolatex turbidimetry),原理,（一）透射比浊法,抗原与抗体在一定缓冲液中形成IC，当光线透过反

18、应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，IC越多透射光越少，可用吸光度表示。,操作步骤,（transmission turbidimetry),方法评价：敏感度高、简便、快速、重复性好,临床意义：沉淀反应的试验 均可用此法。,原理,（二）散射比浊法,在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与IC的含量呈正比。即AgICI。,类型：1.速率散射比浊法 2.终点散射比浊法,（nephelometry),方法评价：敏感度高、简便、快速、重复性好,原理,1.速率散射比浊法,抗原抗体结合反应的过程中，在单位时间内两者结合的速度。即在抗原抗体反应达最高峰时，通常为数十

19、秒，测定其IC形成的量。抗体过量时，峰值与抗原量呈正比。,操作步骤：测定浊度 绘制标准曲线,(rate nephelometry),方法评价：敏感度高(g/L)；快速(不必达平衡）抗原抗体结合的 动态测定,原理,2.终点散射比浊法,让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平衡后，测定其IC形成的量。IC的浊度不再受时间的影响，但反应IC聚合产生絮状沉淀之前，进行浊度测定。,操作步骤：反应十分钟，测定浊度 绘制标准曲线,(endpoint nephelometry),方法评价：敏感度高(mg/L)；时间较长。,透射比浊法和散射比浊法光路,检测器A,检测器B,IC,I0,I,I,透射比浊法,散射比浊法

20、,当复合物3106dal，II;90，散射光的量代表IC的量。,原理,（三）免疫胶乳比浊法,单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。,操作步骤：1.同胶乳凝集 2.测定浊度 3.绘制标准曲线,（immunolatex turbidimetry),方法评价：敏感度高、特异性好、不需特殊设备、试剂 稳定、重复性好。,免疫浊度测定的影响因素：抗原抗体比例(在反应体系中保持Ab过量)；抗体的质量(特异性强，效价高，亲和力强，R型抗体)；反应的溶液（pH6.58.5,磷酸盐缓冲液）；增浊剂的使用。应用：定量测定液体中的微量抗原、抗体等。,抗原抗体的比例对沉淀反应的影响：可用马蹄形沉淀曲线来描述。,当抗原过量时，表现为高剂量的钩状效应。,当抗体过量时，表现为海得堡曲线。,