酶的分离与纯化.ppt

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1、第四章 酶的分离与纯化,一、酶的分离二、酶的精制三、电泳四、酶的浓缩五、酶结晶,一般程序1.预处理和固液分离：加速固液相分离2.细胞破碎分离胞内产物3.初步纯化（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质4.高度纯化（精致）：除去与产物性质相似的杂质5.产品加工,一、酶的分离,（一）发酵液预处理目的：改变发酵液物理性质尽可能使产物转入便于后处理的某一相中去除部分杂质,1、发酵液的相对纯化,（1）无机离子的去除Ca2+常用草酸Mg2+三聚磷酸钠，生成可溶性络合物 Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+Fe3+黄血盐K4Fe(CN)6,形成普鲁(Fe4Fe(CN)63)沉淀 3K

2、4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4Fe(CN)63+12K+,(2)杂蛋白质的去除,1）沉淀法 机理主要是破坏电荷。酸性溶液中与一些阴离子如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸等形成沉淀。碱性溶液中与一些阳离子如Ag2+Cu2+Zn2+Fe3+Pb2+等形成沉淀2）变性法 蛋白质因变性导致溶解度下降而被除去。常见的如加热、大幅度调pH、加有机溶剂和表面活性剂等。3）凝聚和絮凝 用Al2(SO4)3等凝聚剂使蛋白质胶体体系不稳定，通过相互碰撞发生凝集。形成的颗粒较细。絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂（如聚丙烯酰胺类衍生物）的架桥作用下将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。形成的颗粒较粗，用量小，

3、速度快。4)吸附法,(3)色素及其他物质的去除,活性炭：0.1-1.5%离子交换树脂 如DEAE-纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质时，可同时去除非活性蛋 白质,2、发酵液的固-液分离离心和过滤,菌种对过滤速度影响很大 真菌容易过滤，放线菌则难 培养基组成对过滤也有影响,（二）细胞破碎,1、细胞壁与细胞破碎2、细胞破碎的方法1）机械法：珠磨法（bead mill）实验室：Mickle捣碎机；中试：胶质膜处理；工业：高速珠磨机高压匀浆法：大规模细胞破碎方法；对于酵母等难破碎及高浓度细胞可采用多次循环方法；丝状真菌、较小的G+菌，含有包含体（Inclusion body）的基因工程菌不宜用此法。超声波

4、法（Ultrasonication）：杆菌比球菌容易破碎；G-比 G+容易破碎；酵母菌不易破碎；实验室较常用的方法，样品温度？,2）非机械法：酶法、化学法、物理法化学渗透法（chemical permeation）：改变细胞壁或细胞膜的通透性；TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂双层；EDTA：对G-菌外膜有破坏作用；有机溶剂：分解细胞壁中的脂类；变性剂：脲、盐酸胍与水中氢键作用。优点：选择性，易于固液分离。缺点：通用性差，效率低，毒性,JJ-2组织捣碎匀浆机,ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机,（三）酶的提取（extraction）,1、盐溶液提取：盐溶（salting in）在低浓度

5、盐溶液中，酶的溶解度增加。mol/L）。2、酸、碱溶液提取3、有机溶剂提取,（四）离心分离,1、离心机种类(1)常速离心机 最大转速8000 r/min,相对离心力（RCF)1104g(2)高速离心机 1104 r/min转速2.6104 r/min,8103gRCF1105g(3)超速离心机 转速2.5104 r/min,RCF1105g,TGL-16M高速台式冷冻离心机,2、离心分离方法（1）差速离心(differential centrifugation)（2）密度梯度离心(density gradient centrifugation)（3）等密度梯度离心(sendimentation

6、 equilibrium centrifugation)3、离心条件（1）离心力 相对离心力RCF=1.1210-5rn2g（2）离心时间（3）温度和pH,用差速离心法分离亚细胞成分,（五）沉淀分离1、盐析法 盐溶(salting in)在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。盐析(salting out)盐浓度升高到一定程度，蛋白质和酶浓度随盐浓度的升高而不同程度下降并沉淀析出。（1）盐析法的机制（2）盐析用中性盐的选择 常用的中性盐：MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4和NaH2PO4（3）(NH4)2SO4饱和度表示法（4）影响盐析的因素 1）蛋白质浓度 2）pH和温度的影响,蛋白质的

7、盐析,盐析应用最广泛的是硫酸铵,优点 1）溶解度大 25时硫酸铵的溶解度可达4.1mol/L(541g/L)以上。大约每升水可溶解767g之多。在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以被盐析沉淀出来。2）温度系数小 硫酸铵的溶解度受温度影响不大。例如0时，硫酸铵的溶解度仍可达到3.9mol/L(515g/L)。大约每升水可溶解676g。对于需要在低温条件下进行酶的纯化来说，应用硫酸铵是有利的。3）硫酸铵不易引起蛋白质变性，对于很多种酶还有保护作用，且价格低廉，容易获得。缺点 铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。,(NH4)2SO4饱和度表,温度是影响蛋白质溶解度的重要因素。

8、在无盐或稀盐溶液中，温度低，蛋白质溶解度也低；在高盐溶液中，蛋白质的溶解度随温度的升高反而减小。许多蛋白质在高离子强度溶液中，25时的溶解度比0时明显减小。这主要是因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热，温度升高有利于蛋白质失水沉淀。一般盐析时不要降低温度，除非这种酶对温度比较敏感。盐析pH的选择以不降低酶的活性为原则，通常通过试验选择酶稳定的pH范围进行盐析。,盐析法的优点：操作简便、使用广泛、去杂纯化效果好。浓缩作用，有利于进一步纯化。缺点：分辨能力差，纯化倍数低。得到的蛋白质或酶含大量盐粉，需脱盐后进一步纯化。,2、有机溶剂法 利用酶等蛋白质在水溶性有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮）中溶

9、解度降低而使之分离的方法。（1）有机溶剂沉淀法的机理 1）主要效应是降低水溶液的介电常数(dielectric constant)。介电常数用于衡量绝缘体储存电能的性能。介电常数代表了电介质的极化程度，也就是对电荷的束缚能力，介电常数越大，对电荷的束缚能力越强。带电离子基团之间的作用力随介电常数的减小而增大。带电溶质便互相吸引凝集而沉淀。（20时介电常数：水80，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4）2）破坏蛋白质表面水膜，而使蛋白质聚集沉淀。3）作为变性剂，破坏蛋白质氢键等化学键。,有机溶剂沉淀法 优点：分辨率高；密度低，便于离心分离；沉淀不需脱盐；溶剂易于蒸发除去，适于食品工业用酶制剂的制备。

10、缺点：容易使酶变性失活；安全要求较高；操作必须在低温下进行。,（2）有机溶剂的选择和用量 与水互溶有机溶剂包括甲醇、乙醇和丙酮，其中甲醇和丙酮有一定毒性。沉淀能力顺序是丙酮乙醇甲醇。工业上多用乙醇作为沉淀剂。（3）影响有机溶剂沉淀的因素 1）温度 2）pH 3）离子强度 4）蛋白质浓度3、等电点法(isoelectric precipitation)4、其他沉淀法,（六）萃取分离(extraction)概念:P1541、溶剂萃取法 比沉淀分离程度高,比离子交换法选择性好,传质速度快,生产周期段,便于连续操作,容易实现自动化.2、双水相萃取法(Partion of two aqueous pha

11、se extraction)用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液进行萃取.3、超临界流体萃取法4、反胶团萃取法,双水相萃取法,双水相：将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混和时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然地分成互不相溶的两相。如：当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉的水溶液混合时，就得到一个浑浊不透明的溶液，它随之分成两个液相，这就是双水相体系。用于生物分离的高聚物体系有：聚乙二醇(简称PEG)葡聚糖(简称Dextran)和PEGDextran硫酸盐体系。常见的高聚物无机盐体系为：PEG硫酸盐或磷酸盐体系。原理：生物物质在双水相体系中的选择性分配。(酶、蛋白质等生物大分子的分配系数大致在0.1

12、-10之间)。,各种双水相系统,双水相系统的应用,二、酶的精制,根据原理,酶的纯化方法分为:1)沉淀法;2)相分配法;3)柱层析法;4)电泳或离心法。酶纯化的基本原则:1)建立方便灵敏的分析方法;2)选择有效的纯化方法;3)尽量避免变性;4)尽量避免过度暴露于空气中.,酶的理化性质与分离纯化方法,（一）膜分离 原理 利用溶液中溶质分子的大小、形状、性质等的 差别,对于各种薄膜表现出不同的可透性而达到分离的目 的。膜分离技术分为反渗透(RO)、超滤(UF)、纳滤(NF)、微滤(MF)。主要区别在于膜孔径的大小。酶纯化中常用的 是超滤和微滤,特别是浓缩和脱盐。,几种膜分离技术特点,1、透析(dia

13、lysis)原理 P159 1)透析膜 纤维素或其衍生物制成。透析袋已经商品化。2)透析袋预处理 3)透析方法及装置 2.超滤 原理 P164-165 利用具有一定孔径的微孔滤膜，对生物大分子溶液进行过滤（常压、加压或减压），使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、更换缓冲液或浓缩的目的。这种利用超滤膜过滤分离大分子和小分子物质的方法叫做超滤法。超滤膜的截留分子量范围从5000到500000。,透析方法示意图,超滤工作示意图,（二）凝胶过滤法(gel filtration),1、原理,2、凝胶的种类,1.,交联葡聚糖凝胶结构的示意图,葡聚糖凝胶的种类和规格,3、

14、凝胶过滤技术4、凝胶过滤技术的应用,（三）离子交换层析(Ion Exchange Chromatography,IEC),1、原理,离子交换吸附洗脱示意图,2、离子交换剂,3、离子交换技术：P182,（四）疏水层析(Hydrophobic Chromatography),1、原理 一些疏水性较强的介质对疏水性较大的蛋白质有较强的吸附作用，而且吸附后不容易被洗脱下来。尽管多数蛋白质都溶于水，具有较强的亲水性，但实际上分子内部都存在着一个疏水核心中心，分子构象十分复杂。分子内部都不同程度存在着一些疏水基团或疏水中心区。如蛋白质表面含有某些非极性氨基酸侧链，其中包括Leu、Phe、Trp、Ala、P

15、ro等氨基酸，这些非极性氨基酸侧链组成了蛋白质疏水核心中心，决定了蛋白质的疏水性质。P188,2、疏水层析介质：P1883、疏水层析技术：P189,（五）吸附层析(Absorption Chromatography),1、原理 液一固吸附层析是运用较多的一种方法，特别适用于很多中等分子量的样品（分子量小于1，000的低挥发性样品）的分离，尤其是脂溶性成分。一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。,2、吸附介质 常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。（1）硅胶：层析用硅胶为一

16、多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17，吸附力极弱不能用作为吸附剂。,（2）活性炭：使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于80干燥后即可供层析用。层析用的活性炭，最好选用颗粒活性炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱，以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分，如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则

17、较强。例如以醇-水进行洗脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。,3、吸附层析技术：P192,1、原理 将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。具

18、有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。,（六）亲和层析(Affinity Chromatography),亲和层析基本过程,2、亲和介质：P194 载体与配基概念 亲和层析中最常用的载体为琼脂糖凝胶，如Sephrose 2B，4B和6B等，在结合配基前须先经溴化氰(BrCN)活化，然后才能和配基的游离氨基(脂肪族或芳香族氨基)相偶连。3、亲和层析技术：P197-198,三、电泳（electrophoresis）,目前电泳技术已被广泛应用于蛋白质、核酸

19、和氨基酸等物质的分离和鉴定。电泳:溶液中，带电粒子在外加电场的作用下，向相反电极方向移动的现象。影响电泳效果的因素：电荷、大小、介质粘度、pH值、缓冲液的离子强度、电渗、电场强度,1、电泳基本原理,蛋白质的两性电离和等电点,蛋白质是由许多氨基酸通过肽键连成的高分子化合物。每种蛋白质都有特定的一级结构和空间结构。蛋白质空间结构的共同特点是疏水基团（烃基，苯基等）通常隐藏在分子中央，而亲水基团（羧基，氨基，羟基）则暴露在分子的表面。因此，蛋白质是一种亲水胶体。,蛋白质在水溶液中可因这些亲水基团的电离而带有电荷。在酸性溶液中，羧基的电离受抑制，而氨基可与质子（H）结合成正离子。在碱性溶液中，羧基上的

20、（H）可与氢氧根结合成水，使蛋白质带负电荷。蛋白质的这一性质叫两性电离。如果在某一pH时，蛋白质电离成正离子或负离子的程度相等，即蛋白质分子的净电荷为零。则称此pH值为蛋白质的等电点（PI）。,蛋白质的等电点与其分子结构有关。不同的蛋白质由于其分子结构不同而有不同的等电点。如果要分离一组等电点不同的蛋白质，只要选择一个合适的pH，使各种蛋白质在该PH时的净电荷差异最大，就可以用电泳方法达到满意的分离效果。,2、电泳的分类根据被分离样品的多少，可分为分析电泳及制备电泳。根据电泳电压的高低，分为高压电泳及常压电泳：常压电压一般在600v 以下，电位梯度为2-10v/cm。根据是否使用支持介质，分为

21、自由电泳，区带电泳。自由电泳：不用支持介质，电泳在溶液中进行。区带电泳：使用支持介质，应用广泛。根据支持介质的不同，又可分为滤纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖凝胶电泳以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,根据电泳系统的组成是否均一，分为连续电泳，不连续电泳。连续电泳：整个电泳系统使用相同的支持介质和缓冲液。不连续电泳：电泳系统使用不同的支持介质（包括凝胶的浓度与孔径等）和不同的缓冲液（包括缓冲液的组成与pH等）。,3、常用电泳技术,醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。该薄膜对蛋白质样品吸附性小，又因膜的亲水性小，它所容纳的缓冲液

22、也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。醋酸纤维素薄膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后，可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描、测定和膜的长期保存。,过程：膜预处理 加样 电泳 染色 脱色与透明 检测,琼脂糖凝胶电泳 用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳。琼脂糖是从琼脂中分离得到的一种多糖，占琼脂含量的80%，是一种优良的电泳材料，广泛用于同工酶，血浆脂蛋白分离，也可用于免疫电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳 1）聚丙烯酰胺凝胶的聚合：聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰氨（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（BIS）通过化学催化或光催化聚合成三维立体空

23、间的多聚物。化学聚合的催化剂常用过硫酸铵。为加速反应，需加TEMED-四甲基乙二胺作为加速剂。催化反应需碱性环境，如pH为8.3，丙烯酰胺的浓度为7%，30min就可聚合完毕。,2）聚丙烯酰胺凝胶的孔径与机械强度 聚丙烯酰胺凝胶的分离效果与凝胶孔径有关，凝胶孔径由凝胶总浓度和交联度决定。凝胶总浓度T（g/dl）表示100ml凝胶中丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的总克数。T值越大，孔径越小。交联度C表示交联剂BIS占凝胶总浓度T的百分比。C值越大，孔径越小。3）聚丙烯酰胺凝胶的高分辩率主要归结于以下3种效应（1）浓缩效应：导致蛋白质样品被压缩为一个薄层。（2）分子筛效应：凝胶有一定的孔径，不同的蛋白质

24、通过凝胶时受到不同的阻力。小分子受到的阻力小，跑在前面；大分子受到的阻力大，跑在后面。（3）电荷效应,SDSPAGE电泳 SDS又叫十二烷基硫酸纳，是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质分子带上大量SDS阴离子（负电荷），大大超过了蛋白质原有的电荷，从而掩盖了各种蛋白质原有的电荷差异（可近似认为各种蛋白质分子带电荷相等）。因此，蛋白质的电泳迁移率仅仅反映了各蛋白质分子量的差别。分子小，电泳时跑得快，分子大，电泳时跑得慢，因而能将分子量不同的蛋白质分开。SDSPAGE是测定蛋白质分子量的最好方法。,四、酶的浓缩（concentration）,蒸发胶过滤超滤反复冻融PEG浓缩冻干,冻干机,五、酶的结晶

25、（crystallization）,第四章 思考题,1、细胞破碎的方法有哪些？简述其特点。2、发酵液预处理的目的？主要去除哪些物质？3、盐溶、盐析、双水相萃取法、超临界流体萃取法、膜分离、透析、超滤4、酶提取中涉及哪些技术方法？5、盐析法的机制？6、盐析法常用中性盐？7、盐析法最常用的无机盐是什么？有何优缺点？哪些因素影响其盐析效果？简述盐析的基本操作过程。8、有机溶剂沉淀法的机理？有何优缺点？常用的有机溶剂？9、比较膜分离技术特点。在酶分离纯化中常用哪些膜分离技术？10、在酶的分离纯化中，凝胶过滤法用途有哪些？11、简述离子交换技术基本过程。12、比较凝胶过滤、离子交换、吸附层析、亲和层析工作原理。13、聚丙烯酰胺凝胶电泳具高分辨率原因？14、目前测定蛋白质分子量的最好方法？简述工作原理。15、酶浓缩的常用方法？16、查阅一篇酶分离纯化与酶学特性研究的综述或研究性文章。,