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1、 DNA,DNA分子的大小为49 Kb，其中的绝大多数基因都得到了确定和定位。基因图谱的一个特征是功能上相关的一系列基因在基因组中聚集在一起。这种簇集现象，在以噬菌体为基础的克隆载体构建中，也起着非常重要的作用。,可以插入超过10 Kb的外源DNA。该载体携带的lacZ基因上有一个多克隆位点接头，外源基因插入到多接头上6个酶切位点中的任何一个，都会使该基因失活，从而使得噬菌斑是无色清澈的而不是蓝色的。,(2)ZAPII,Spi 重组子的筛选,3.5 基于M13噬菌体的载体,3.5.1 M13纤维状噬菌体,M13是纤维状噬菌体的一个代表，在结构上与噬菌体有着很大的不同。M13 DNA分子比DNA
2、要小得多,仅有6 407个核苷酸。基因组为环状单链DNA。M13的衣壳仅仅是由3种不同的蛋白质组装而成，而噬菌体的头尾结构则包含15种不同的蛋白质，而且M13的侵染周期相对来说也要简单一些，并不需要将基因插入到宿主基因组中。,M13-filamentous phage,Genome:Single stranded circular DNA molecule,covalently closed,6 407 nucleotides10 non overlapping genesHoused in a flexible protein cylinder,M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括
3、复制蛋白（基因，和），形态发生蛋白（基因，和），结构蛋白（基因、和）。所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。,M13 DNA分子通过大肠杆菌的纤毛进入细菌细胞,在宿主细胞内，单链DNA分子作为模板生成一条互补链，形成正常的双链DNA分子（replication form,RF）。这个双链DNA分子不会插入细菌基因组，但会持续复制直到细菌中的拷贝数超过100。当细菌分裂时，每个子细胞都能得到一个或多个噬菌体基因组的拷贝，这些拷贝也能继续复制，以保证每个细胞具有恒定的拷贝数。,RF DNA再以滚环方式进行复制，形成完整的单链子代DNA，接着新合成的子代DNA被切下来，并进一步环化形成
4、单位长度的M13基因组DNA。游离的M13基因组DNA被不断包装成为M13噬菌体颗粒，并释放出来。每个被侵染细胞在经过一代复制后，都能够产生 1 000个新的噬菌体。,M13的侵染循环,一个正常的M13噬菌体的基因组是6.4 Kb，紧密排列着10个基因，每一个基因对噬菌体的复制都是必须的。基因间有一长为507 bp的短序列，外源DNA片段必须从这里插入才不会损伤其他的基因，同时还必须保证该序列中的复制起点不被破坏。显然，只有一个很小的空间可用于改造M13噬菌体。,M13噬菌体DNA组织结构,M13作为克隆载体的吸引力,它的基因组小于10 Kb，对一个潜在的载体来说恰好处于一个令人满意的范围内。
5、M13基因组的复制型非常像质粒，因此也能像质粒一样被处理。而且，M13基因组容易从大肠杆菌培养中获得，也能够通过转染而重新引入。以M13为载体克隆基因，能够得到单链形式的DNA。单链形式的克隆基因在一些技术中能够发挥作用，在DNA测序和体外突变产生中尤为明显。,3.5.2 M13mp2克隆载体的开发,构建M13克隆载体的第一步，是把lacZ基因导入到噬菌体M13的短序列中。这样就产生了M13mp1，它在含有X-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。,M13mp1的lacZ基因上不含有任何限制性酶切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一个GGATTC的序列。改变一个核苷酸就变成了GAATTC，这是Ec
6、oR I的识别位点。M13mp2的lacZ基因的第6个密码子编码的是天冬酰氨而不是通常的天冬氨酸，但转染了M13mp2的细胞产生的-半乳糖苷酶仍然有着正常的功能。,3.5.3 M13mp7对称的克隆位点,由于携带对称的克隆位点，用M13mp7载体有一个很大的好处，无论新的DNA是通过BamH I，Sal I或Pst I中的哪一个酶切位点插入载体，都可以用EcoRI从重组体中切除。,3.5.4 M13mp8/9载体,越精巧的M13载体越有更复杂的多接头被插入到lacZ基因中。M13mp8是pUC8的对应物。和pUC8一样，它允许具有两个不同粘性末端的DNA片段的插入。,M13mp9是M13mp8
7、的姐妹载体，它有一个与M13mp8相同的多接头，但是方向相反，当把一个DNA片段克隆到M13mp8后，可以用两种限制性内切酶把它再切下来，然后可以把它以相反的方向连接入M13mp9。这在DNA测序中很重要，因为核苷酸序列从多接头的一端一直读进插入的DNA片段。通常一次测序只能读出约600个碱基，如果插入的DNA超过了这个长度，就有一个末端的序列读不出来。一种解决的办法就是把DNA换个方向，再插入到姐妹载体中。,4.M13和质粒的杂交载体噬菌体质粒,M13可以产生单链DNA，这使得它非常有用，但它有一个很大的缺点。当用M13作载体时，它可以容纳DNA片段的大小十分有限。为了解决这一问题，人们把M
8、13基因组的一部分和质粒DNA结合在一起，构成一种新型的载体，叫做噬菌体质粒（phagemids）。,pEMBL8载体,它是通过把M13基因组中一个1 300 bp的片段导入pUC8中而构建的。M13在形成被分泌的噬菌体颗粒前有一种酶使双链DNA变成单链DNA，而被导入的那一段M13 DNA则含有这种酶识别的信号序列。尽管这段序列已经从M13噬菌体基因组中被分离出来，但它的功能还在。所以，pEMBL8也可以转化为单链DNA。,用作pEMBL8克隆实验的宿主大肠杆菌细胞必须随后被正常的M13噬菌体感染，而在这里正常的M13噬菌体作为辅助噬菌体，提供必要的复制酶和蛋白质外壳。pEMBL8是从pUC
9、8发展来的，同样也有插入多接头的lacZ基因，重组体可以通过在含有X-gal培养基上的噬菌斑而被鉴定出来。我们可以用pEMBL8产生达到10 Kb的单链DNA片段，这极大地扩展了M13克隆系统的使用范围。,1.具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；,2.编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；,3.拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA；,4.存在着一
10、个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；,8.在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA；,5.阳性重组子可以用蓝白斑进行筛选；lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；,6.含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子；,7.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装
11、成噬菌体颗分泌到培养基中；,9.可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一繁琐的亚克隆步骤。,pUC118和pUC119 1.具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择；3.拷贝数含量高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA；4.存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不
12、经修饰便可直接插入到载体分子上；,5.阳性重组子可以用蓝白斑进行筛选；lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；6.含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子7.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；,8.在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA；9.可以直接对克隆的DNA片断进行
13、核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一繁琐的亚克隆步骤。,pBluescript噬菌粒载体,3.编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化子标记；4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG显色反应法筛选噬菌粒载体。,1.在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子，可以定向指导外源基因的转录活动；2.同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取不同的复制形式，分别合成单链或双链的DNA；,5 粘端质粒,粘端质粒(cosmids,柯斯质粒)是噬菌体DNA和大肠杆菌质粒两者的杂交体。设计粘端质粒的想法来源于这样一个事实：把噬
14、菌体DNA包装进头部的酶仅仅识别cos位点。在体外包装系统中，任何长度在37 Kb和52 Kb之间的DNA分子，只要两端含有cos位点，就能够包装进噬菌体的头部。构建cosmids是为了克服把大片段DNA导入到大肠杆菌细胞中的技术难题。,粘端质粒基本上算是一个携带cos位点的质粒。cos位点用于把重组DNA装入噬菌体的头部。因为它缺少几乎所有的噬菌体基因组，不能产生噬菌斑，因此需要其他的筛选标记，如氨苄青霉素抗性标记，也要有质粒的复制起点。,粘粒具有来自ColE1的复制起点，可以在大肠杆菌进行复制，具有AmpR作为选择标记，利用体外包装系统选择携带外源DNA插入片段的重组体，并侵染宿主细胞。外
15、源DNA片段与粘粒载体的连接类似于外源DNA片段和置换型载体的连接。连接产物是由45 Kb的外源DNA片段和5 Kb粘粒载体构成的连环体。对连环体进行体外包装形成病毒颗粒，并用于侵染大肠杆菌细胞。连环体的包装仅仅起到筛选重组体，并把50 Kb的DNA分子转到细菌细胞内。50 Kb的片段的转化效率非常低，而噬菌体的侵染效率非常高。,采用粘端质粒的克隆实验按照如下步骤进行。从单酶切位点切开质粒，加入新的DNA片段，这些片段通常是不完全酶切的产物，完全酶切后产生的片段对于粘端质粒来说太小了。然后，进行连接反应，形成重组体。如果插入的DNA大小合适，体外包装系统从cos位点切开连环体，把重组后的粘端质
16、粒包装进成熟的噬菌体颗粒。用这样的噬菌体去感染大肠杆菌，但不会产生噬菌斑。把感染后的大肠杆菌培养在选择性培养基上，只有那些有抗生素抗性的菌落才能生长。所有的菌落都是重组体，因为那些没有重组的线性粘端质粒太小，根本不可能包装进噬菌体的头部。,A sequence marked“ori”for DNA replication in bacteria;Ampr for ampicillin selection in bacteria;A sequence marked MCS that is a polylinker containing unique restriction sites and t
17、wo phage RNA polymerase promoters(T7 and T3)in opposing directions.Two cos sequences,separated by an Xba1 site;An origin of DNA replication from SV40(permits replication and copy number amplification in many eukaryotic cells,in the presence of SV40 T antigen protein);Neor for selection in eukaryotic
18、 cells with the neomycin antibiotic analog G418.,The maximum amount of DNA that can be inserted into SuperCos I depends on the packaging limit of lamba(52 kbp)and the pre-existing size of the vector(7.6 kbp).,6 其他高容量载体,基于噬菌体的载体的主要用途是克隆DNA大片段。做个比较，M13载体可以插入不超过3 Kb的DNA片段，大多数质粒的容量不超过8 Kb，对于像EMBL4那样的置换载
19、体能够达到20 Kb，对某些粘端质粒而言是40 Kb。,这样可以克隆如此巨大的DNA片段的能力，使得人们可以建立基因组文库。一个基因组文库就是一套覆盖某个生物体所有DNA的重组体克隆群。例如，一个大肠杆菌的基因组文库，包含所有的大肠杆菌基因，据此，我们可以抽提出任何我们所感兴趣的基因加以研究。基因组文库可以保存很多年，也可以很容易地在研究组织间传播。,由于人类和其他哺乳动物的基因组很大，因此需要构建新的容量更大的载体。人类已经开发出一系列这样的载体，并且很快应用到基因组物理图谱的构建工作。,Bacterial artificial chromosome(BAC)vectors,以大肠杆菌为宿主
20、的克隆载体多属于多拷贝复制子。这类载体的优点是在宿主细胞中有较多的拷贝数，因此可以获得更多的克隆片段。但是，这类载体也有一个明显缺点，即插入片段不稳定。当插入片段来自于含有重复顺序的真核基因组时，插入片段的不稳定现象就尤为突出，因此在细菌细胞中就很难保持完整的大片段DNA。,为了避免高拷贝数目载体中插入片段不稳定这一问题，人们开始利用低拷贝数目复制子，例如F-因子，来构建载体。利用F因子构建的载体可以克隆50300 Kb的外源DNA片段。BAC载体含有F质粒的复制起点（oriS），控制质粒复制的基因（repE）,确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因（parA,parB），以及细菌的氯霉素乙酰
21、转移酶基因。,构建BAC文库的方法与构建标准质粒文库的方法相似，只是DNA插入片段是通过脉冲电泳制备的。pBeloBAC11是一种BAC载体。由HindIII部分酶切，通过PAGE分离得到DNA片段连接到通过HindIII 酶切，并通过磷酸酶水解的pBeloBAC11上，连接分子通过电击导入大肠杆菌细胞中，在含有氯霉素的培养基上筛选重组体。插入片段可以利用稀有位点限制性内切酶NotI切割下来。terminase可以在cosN位点切开质粒。可以对线性化质粒进行末端标记进行限制酶作图。HindIII克隆位点两侧的T7和SP6启动子可以被用作制备RNA探针进行文库筛选。,BAC载体的优点是通过很多代
22、的传递，仍保持稳定，并且BAC能够通过电击的方法高效地导入大肠杆菌细胞，避免了体外包装过程。,P1 噬菌体载体（Bacteriophage P1 vectors）,它含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳 70100kb 大小的基因组DNA片段。在这种系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到 P1 噬菌体颗粒中，后者总容量可达 115kb（包括载体和插入片段）。将重组 DNA 注射到表达 Cre 重组酶的大肠杆菌中，线状 DNA 分子通过重组于载体的两个 loxP 位点之间而发生环化。另外，载体还携带一个通用的选择标记 kan r，一个区分携带外源 DNA 克隆的阳性
23、标记 sacB 以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的 P1 质粒复制子。另一个 P1 复制子（P1 裂解性复制子）在可诱导的 lac 启动子（IPTG 诱导）控制下，用于 DNA 分离前质粒的扩增。,它含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳 70100kb 大小的基因组DNA片段。在这种系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到 P1 噬菌体颗粒中，后者总容量可达 115kb（包括载体和插入片段）。将重组 DNA 注射到表达 Cre 重组酶的大肠杆菌中，线状 DNA 分子通过重组于载体的两个 loxP 位点之间而发生环化。另外，载体还携带一个通用的选择标
24、记 kan r，一个区分携带外源 DNA 克隆的阳性标记 sacB 以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的 P1 质粒复制子。,P1 噬菌体载体（Bacteriophage P1 vectors）,正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。如蔗糖致死基因 SacB，来自淀粉水解芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），编码果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。,P1噬菌体载体构建基因组文库的示意图,pAd10 sacB ScaI+Ba
25、mHI 长臂+短臂 加入外源DNA片段 重组DNA分子 离体包装 感染宿主细胞,还有一些大容量的载体使基于噬菌体P1发展而来的。P1优于的地方在于，它能够在它的蛋白质外壳中挤进110 Kb的DNA分子。基于噬菌体P1设计的粘端质粒可用于克隆长度从75 Kb到100 Kb的DNA。还有一种载体，结合了P载体和BAC的特点，称为P衍生的人工染色体（P1-derived artificial chromosome,PAC），同样也拥有超过300 Kb的容量。,Types of vectors,Plasmid-based,Virus-based,Chromosome-based,Phage-based
26、,Eukaryotic virus-based(to be reviewed in gene therapy section),YAC,BAC,PAC,Hybrid(phagemid,cosmid etc),Cloning vector Size of insertStandard high copy number plasmid vectors 0 10 kbBacteriophage insertion vectors 0 10 kbBacteriophage replacement vectors 9 23 kbCosmid vectors 30 44 kbBacteriophage P1 70 100 kbPAC(P1 artificial chromosome)vectors 130 150 kbBAC(bacterial artificial chromosome)vectors up to 300 kbYAC(yeast artificial chromosome)vectors 0.2 2.0 Mb,Sizes of inserted DNA commonly obtained with different cloning vectors,
