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1、第十章 转基因技术与应用,转基因植物转基因动物转基因微生物,转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。人们常说的遗传工程、基因工程、遗传转化均为转基因的同义词。,第一节 转基因植物 p85,目的基因和受体的获得转基因方法转基因植物的鉴定转基因植物的应用转基因植物研究存在的问题,一、目的基因的来源,采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因；通过mRNA合成cDNA；人工合成的DNA片段；聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。,二、转基因植物受体包括：叶盘
2、、胚轴、茎尖、茎段原生质体悬浮细胞愈伤组织胚状体活体,三、转基因方法直接导入法物理法：基因枪法、电击法、超声法、显微注射法、激光微束法化学法：PEG法，脂质包埋法等载体介导法：农杆菌介导、病毒介导法花粉管通道法,枪击法将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力为430 m/s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶子等，但进去的DNA片段整合效率极低。电击法将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在 200-600 V/cm 的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长 1-2 周，再生出整株植物。,直接导入法,融合法将外源DN
3、A与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。,T-DNA的染色体整合机制,载体介导法,农杆菌介导法p87,共整合转化程序,二元整合转化程序,病毒介导法,随着植物病毒分子生物学及遗传学研究的不断深入，用病毒基因组作为载体转化植物细胞日益受到人们的重视，因为病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限制。在大约300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA病毒约占91%，双链RNA病毒、双链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。利用植物病毒载体转化植物细胞大致有以下两种战略：转染植物细胞
4、原生质体转染植物组织,花粉管导入法,将外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。这一方法是我国科学家周光宇首先提出设计的，目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。花粉管导入法的特点是直接、简便。它的受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍，特别适合于难以建立有效再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高。,四、转基因植物的鉴定选择培养基检测：如Ti质粒改造时插入抗生素标记基因遗传标记检测：选择标记治理，如含有-葡糖苷酸酶、荧
5、光素酶基因等目的基因检测：PCR、分子杂交等,五、转基因植物应用,植物基因改良 抗虫害植物、抗除草剂植物、高品质植物转基因植物生产药物,富含维他命A的黄金大米,转基因番茄（抗花叶病基因）,转基因棉花（Bt基因）,抗虫玉米,转基因植物,1983 年 美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜。1994 年 世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市。1995 年 转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入生产。2000 年 美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆。迄今为止 世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大
6、豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴、桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。,应用于生产转基因药物的植物,六、转基因植物研究存在的问题,环境释放安全性食品安全性,生物安全的含义,生物安全使指在一定的时间与空间范围内，由于自然或人类活动引起外来物种迁移，外来物种在定居、建群、繁衍、扩展的连串过程中造成对本土物种和生态系统的威胁、危害，使之衰退，甚至退化和灭绝；或由于人为造成环境的剧烈变化，导致生态环境的破坏或掠夺生物资源，砍伐和捕捞过度，严重时导致物种濒危或灭绝；或由于科学研究、开发、生产和应用中造成对人类健康、生存环境和社会
7、生活的有害影响。这三种情况均属于生物安全范围，第一种其实是外来物种入侵，或角生物入侵。第二种情况是生态环境的破碎化、片断化和边缘化，同样使生物多样性受到威胁。第三种情况是指生物技术和生物工程引起的生物安全问题，是科技进步带来的负面影响，主要包括转基因农作物的生物安全问题。,生物安全问题的提出与演化,1973年在美国新罕布尔州举行的哥敦会议上（Gordon），在讨论核酸问题时，许多生物学家对即将到来的大量基因工程操作的安全性提出担忧；1975年2月，在美国加州阿西罗玛（Asilomar）举行了一次国际会议，第一次正式讨论转基因生物的安全性问题；1976年，美国国立卫生研究院（NIH）发布重组DN
8、A分子研究准则，随后，德、法、日、澳等也相继制定了有关重组DNA技术德安全操作指南或准则，经济发展合作组织（OECD）颁布了生物技术管理条例，欧盟颁布了关于控制使用基因修饰微生物的指令、关于基因修饰生物向环境释放的指令等。1992年6月，联合国环境与发展大会通过生物多样性公约，直至2000年1月正式通过生物安全议定书。1993年，国际经济合作与发展组织（OECD）提出转基因食品安全性分析原则是“实质等同性”原则。即转基因食品及其成分应与市场上销售的对应食品具有实质等同性。这种等同性包括表型性状、分子特性、主营养成分及抗营养因子。2001年5月23日，中国国务院第304号令颁布了农业转基因生物安
9、全管理条例。该条例共分8章，分别是总则、研究与试验、生产与加工、经营、进口与出口、监督检查、罚则、附则等。,转基因生物的潜在生态风险,转基因生物的“基因污染”造成生态问题，引起杂草化。,1998年，加拿大Alberta省发现一种Canola油菜，它由于基因污染而含有抗草甘膦、抗固沙草、抗咪唑啉类除草剂等三掌转基因堆积而成的“光谱抗除草剂基因”（HT基因）。这种多抗性怪异油菜的种子爆荚、休眠期长、种子很小、圆而光滑，可随风传播到相当远的距离，更易造成基因污染和扩散，而一般除草剂对它无可奈何，成为多抗性的“超级杂草”。另一个有名的例子是：J.E.Losey 1996年在Nature杂志发表的一篇报
10、导：他们用转Bt基因玉米花粉的马利筋叶片来饲喂大斑蝴蝶幼虫，对照组是加普通玉米花粉的马利筋叶片及不加玉米花粉的马利筋叶片，结果转基因玉米花粉的叶片饲喂幼虫后，第二天死亡10以上，4天后死亡44。而对照组全部存活。这就表明，Bt转基因玉米花粉可能威胁大斑蝴蝶的生存,引起生态种群的破坏。,转基因生物对农田生态系统的潜在风险,增加杀虫剂的使用。由于转基因生物可能造成的影响是抗药基因的特性选择和转移或漂流到可相容的其他植物中，形成抗性杂草或超级杂草，具有很强的抗药性。产生新的农田杂草。其原因是由于基因漂流或基因逃逸，如通过昆虫传播花粉引起杂交或基因污染，使近缘种变成新杂草或超级杂草。转基因植物自身变为
11、杂草。由于插入性状的竞争而演变退化为杂草。产生新的病毒。由于不同病毒基因组和转基因作物的病毒外壳蛋白重组而出现新型病毒。广谱抗除草剂堆积基因群（HT）的超级杂草。产生新的作物害虫。由于病原体与转基因植物相互作用或是草食动物与转基因植物相互作用而出现的新型转基因害虫。比如常见害虫产生抗性，并进化增强。对非目标生物的伤害。由于误食或基因污染导致。例如2002年10月美国内布拉斯加的一块约一英亩的刚收获大豆的田里，发现了三株转基因玉米。这是因为上一年种植的含一种胰岛素蛋白的药用转基因玉米的种子遗留下来在田里发芽，结果导致总价值270万美元的这一季大豆不得不付之一炬。,转基因生物对自然生态系统的潜在风
12、险,侵入到新的栖息地。通过昆虫、鸟类、风力等媒介使转基因花粉四处扩散，造成基因污染，威胁生物多样性安全。丧失生物多样性。转基因生物通过生存竞争、环境胁迫或其他不确定性因素增加的影响（基因、种群或物种），使生物多样性受损害或者丧失。对非目标本土物种的伤害。由于改变互惠共生关系导致。营养循环和环境生物地球化学过程的改变。生物与非生物环境的相互作用关系改变导致。初级生产力的改变。改变物种的组成和结构以及转基因植物的不同性状，都可能导致在不同程度上影响初级生产力的变化。增大土壤流失。,转基因生物对健康安全的潜在风险,转基因食品有毒性吗？转基因食品可能造成过敏吗？转基因食品中的标记基因会不会有危险？一些
13、具有抗除草剂或毒杀害虫功能的基因，是否会通过食物链进入人体内而影响健康？外源性目的基因转入移植后是否会产生新的有害遗传性状或不利于健康的因素？转基因食品对人类的生殖遗传是否会有影响？等等。,毒性问题：虽然迄今还没有具说服力的研究报告说明转基因食品（GMF）的毒性，但由于转基因作物可能产生“非预期后果”，因此由其加工的食品可能存在潜藏的健康风险。例如，据1998年报导，转基因马铃薯引起大鼠器官生长异常。英国2002年的研究称，转基因大豆制成的汉堡包食用后，在排出的粪便中仍含有转基因DNA的成分，表明抗除草剂基因可存在于肠道细菌内并没有被完全消化。又如，马铃薯中本来含有毒素茄碱（绿马铃薯），转基因
14、马铃薯中茄碱是增加还消除了呢？,过敏反应问题：过敏性风险史医学上的“变应原性风险”，一般人和动物是非常低的，但转基因作物可能诱发或家中变应原性风险。转基因作物带有外源基因，即具有新的蛋白质，这些新蛋白质可能引起食用者或接触者出现过敏反应。人类在自然环境中进化形成的人体免疫系统可能难以或无法适应转基因生成的新型蛋白质而诱发过敏症。例如，安万特公司推出的“星联玉米”，是含有杀虫蛋白Cry9C的转基因玉米，结果少数人吃了之后引起皮疹、腹泻或呼吸系统的过敏反应并有潜伏效应。1998年美国环保局比准“星联玉米”生产时，明确规定只准供动物饲料之用，不能作为食品。2000年9月，发现美国市场的玉米面饼等30
15、0多种产品中含有微量“星联玉米”，引发大风波。为回收被“星联玉米”污染的玉米食品，安万特公司花费了约10亿美元。这就是在转基因安全史上著名的“星联玉米”事件。,抗药性问题：转基因操作中常常需要使用标记基因，而抗药性基因是用得最多的标记基因。如氨苄青霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因，四环素抗性基因，新霉素抗性基因，放线菌素抗性基因等等。这些抗性基因会一直存在于植物器官中，通过食物链可能会被传入人畜消化系统中细菌体内，使这些细菌对抗生素药物的治疗产生抗性。而抗生素是用来治疗各种非常严重疾病的药物，如果抗生素失效，那么挽救人类生命就成为问题。例如，氨基丁卡霉素被认为是人类医药中的“保留”或“急救”抗生
16、素，是国际医药界储备的应急“救危”药物，而现在却为GMO捷足先登，并滥用于多种GMO作为标记基因，广泛在环境中释放，在各种动植物机体内产生抗性。,有益成分问题：研究发现，外来基因会以一种人们目前还不甚了解的方式破坏食物中的有益成分。如英国伦理与毒性中心的实验报告称：与一般天然大豆相比，在两种耐除锈剂或抗除草剂的转基因大豆中具有防癌功能的异黄酮成分分别减少了12和14。GMO中插入的外源性目的基因改变了生物自身原有的复杂生物化学路径，改变了原有的新陈代谢，其生化作用的结果很难预料，还可能受环境条件变化的影响而导致变异。,免疫力问题：转基因生物及其产品有可能降低动物乃至人类的免疫能力。,转基因食品
17、的概念,转基因食品是指那些转入由植物、动物或微生物的细胞中提出的基因，从而获得某些良好特性的生物所制成的食品成为转基因食品或基因改造性食品,转基因食品的主要功能：1 高产、生产期短、抗病、抗虫害和便于运输、储存2 改造食品营养成分含量、防病和增强体质抗金属作物的清除土壤中污染的重金属能力,转基因作物的种类主要有:大豆、玉米、棉花和油菜等,这四类作物占全部转基因植物的86%，其中75%种植在北美。从转基因作物的性状来看,主要有抗除草剂、抗虫、抗病等几类。目前世界上转基因作物种植面积最多的是：抗除草剂大豆种（占转基因植物总面积的40%）；抗虫玉米（占23%）；抗病烟草（占13%）；抗除草剂油菜（占
18、10%）；抗虫棉花（占8%）；抗除草剂棉花（占3%）。,转基因食品的安全性评价,转基因食品的安全性评价是一个很复杂和需要较长时间试验才能得出结论的问题。转基因食品的安全性应着重从宿主、载体、插入基因、重组DNA、基因表达产物和对食品营养成分的影响几方面考虑。,转基因食品的安全性评价原则IFBC提出采用判定树（decision-tree）的原则与方法对转基因食品进行安全性评价。1)了解被评价食品的遗传学背景与基因改造方法；2)检测食品中可能存在的毒素；3)进行毒理学实验。,FAO/WHO联合专家评议会制定的生物技术食品的安全性评价政策与原则着重强调：1)安全性评价应与科学为依据，不能过高估计该类
19、食品的危害性，也不能过低估计该类食品可能存在的问题。2)任何生物技术食品的安全性评价应首先阐明其分子、生物学和化学特性。3)对基因改造微生物而制作的食品，如果其分子、生物和化学分析表明与传统食品一致，则主要对其杂质和加工过程进行评价，强调在加工过程中实施HACCP和GMP。4)对基因改造的动物性食品，动物本身的健康可作为安全性评价的标志。5)对已进行安全性评价并批准用于消费的食品，需进行有计划的使用后的人群健康监测。,转基因食品的安全性评价的方法对转基因食品从营养与毒理学两方面按个案进行评价。在对一种转基因食品进行安全性评价时，应首先了解其背景资料，包括食品名称、来源（动物、植物或微生物）、基
20、因改造方法（宿主、载体、插入基因、重组生产体的特性）、人体摄入量、使用目的及使用人群（是否是特殊人群，如孕妇、儿童等）、加工方法及食品成分等，同时确定待评价的试验样品与实际生产的和人类实际消费的食品是否一样。,1)SAFEST 1类食品：与传统食品极其相同或相似的基因改造食品，不必进一步证明其安全性。2)SAFEST 2类食品：与传统食品极其相似，但存在某个新成分或新特性或缺乏某一个新成分与特性的基因改造食品。需要对其不同的成分与特性作进一步的分析评价。3)SAFEST 3类食品：与传统食品既不相同也不相似的基因改造食品，需要作广泛的毒理学评价。,1)关于急性毒性的试验结果;2)关于亚急性毒性
21、的试验结果;3)关于慢性毒性的试验结果;4)关于对生殖产生影响的试验结果;5)关于变异原性的试验结果;6)关于癌原性的试验结果;7)其他必要的实验结果(肠道毒性试验结果等)。,实质等同性原则：即转基因食品和传统同类产品比较特性、化学成分、营养成分、所含毒素等评价方法：Monsanto公司的评价方法：1）插入基因所表达蛋白的安全性评价2）营养水平的比较3）健康显示测试全食物饲喂研究数据库的应用活体或离体动物模型 转基因食品致敏性的评价PCR检测的方法,国外对转基因食品管理的有关法规,1 在FAO/WHO召开的第23届(1994)食品标签法典委员会会议上同意由美国官方机构负责起草食品标签的生物学技
22、术关联指南草案。美国方面提出转基因食品安全无害，应与其它食品同等对待而不必强制性标签。第25届(1997)食品标签法典委员会会议对指南草案再次拟稿，提出了一个关于采用生物技术制备食品的标签的推荐意见的提案，要求对转基因食品加施GMO(基因改良有机体)标签。,2 欧洲议会于1997年5月15日通过了新食品规程的决议，规定欧盟成员国对上市的转基因产品必需要有GMO的标签,这包括所有转基因食品或含有转基因成分的食品。标签内容应包括：(1)GMO的来源；(2)过敏性；(3)伦理学考虑；(4)不同于传统食品(成分、营养价值、效果等)。1998年9月1日欧盟增补了标签指南，规定来自于转基因豆类和玉米的食品
23、(目前不包括食品添加剂如大豆卵磷脂)必须标签。如果食品的原料及在加工过程中没有添加转基因的成分，则可标示非转基因食品的标签。,3 澳大利亚、新西兰于1999年5月起实施转基因食品标准，规定对用基因工程技术生产的食品必须进行安全性评价，如在安全性评价中未获认可，将不得进入市场销售。4 俄罗斯政府规定，从1999年7月1日起，进口转基因食品必须经俄有关部门质检。俄授权医学科学院食品研究所和国家生物工程中心对进口转基因食品进行质检。5 瑞士联邦政府规定，食品中转基因成分不超过1%的，不需在标签上标明；超过1%或无法确定的，需在标签上说明。,6 加拿大还没有要求强制性地对所有转基因食品作标签表述，但只
24、要其表述是真实而无误导的，就允许并鼓励食品生产商进行自愿性的标签表述。当基因突变导致对部分消费者造成可能的健康与安全风险时，基因工程生产的食品应实行强制性标签要求，比如当引入某种已知的过敏原或对食品的构成或营养成分发生变化时。,我国的对策,我国目前还没有方法对转基因食品进行检测，也没有相应的管理办法和法规来进行监管1 借鉴国外的通行做法，制订一部专门的法规来加强对转基因食品的管理要求出口国必须对转基因食品加贴标签检验检疫机构应对进入我国市场的进口转基因产品实施申报、登记制度。登记内容主要包括：产品名称、来源（动物、植物或微生物）、基因改造方法（宿主、载体、插入基因、重组生产体的特性）、人体摄入
25、量、使用目的及使用人群（是否是特殊人群，如孕妇、儿童等）、加工方法及食品成分等。出口国应向我国检验检疫机构提供经过安全评价方面的证明，并承诺承担种植和消费转基因产品可能引起的风险。,2 加紧开展对转基因食品的检测和安全评价工作。1）加紧开展对转基因食品的检测工作2）加紧开展对转基因食品的安全性评价工作3 国内公司进口食品时应要求外方对转基因食品予以申明和加贴标签,转基因植物产品的检验技术,转基因植物产品的安全性评估极为重要，但可能更为受到人们关注的是转基因产品的检测技术。目前要测试植物产品是否含有基因改造成分，或植物产品是否经过基因改造，主要有两种方法：1 检测是否有外来基因或DNA；2 检测
26、是否有外源的蛋白质。方法1是基于PCR技术，此技术能检测样本中是否有外耒基因，既使外耒基因量极微，PCR技术也能精确检测，检测包括检测目标基因、标记基因和引物等不同方法。由于方法1操作简便，结果精确，所以其是欧美实验室采用最为广泛的方法。方法2操作麻烦，有待进一步改进，部分欧美实验室亦有采用。,第二节 转基因动物p154,定义动物转基因的流程转基因方法转基因动物鉴定转基因动物应用,将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定整合有人工导入外源基因的动物称为转
27、基因动物（transgenetic animal）。,将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育；移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代其细胞中都携带有转入的外源基因；利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。,动物转基因的流程,外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系,动物转基因的流程图,基因的转移的方法,电穿孔法显微注射法磷酸钙DNA共沉淀法脂质载体包埋法病毒介导的生物学方法,电穿孔法实
28、现外源基因的转移,利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的基因转移。,显微注射转基因技术,利用显微操作技术转移外源基因的方法。此法转入基因长度可达数百kb；并能随机地整合在受体细胞染色体DNA上，因此应用范围广。但是这种整合有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。,磷酸钙DNA共沉淀法基因转移技术,这种方法是受二价金属离子能促进细胞吸收外源DNA的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。但转移效率较低，仅有1%5%的外源DNA可以进入受体细胞核中，大约仅有1%的DNA可
29、以在细胞中稳定表达。,脂质载体包埋法,将需要转移的外源DNA或RNA包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源DNA转入宿主细胞。这种方法转基因效率高。,病毒介导的生物学方法,基因显微注射法胚胎干细胞移植法反转录病毒法,重点介绍,通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，48小时后再注 射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般情况下5-10个，超 数排卵为35个；与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵；将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内；将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内；
30、受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代；从小鼠子代体内取出DNA样品，进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位 点；子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达。,DNA显微注射法的基本程序,一、基因显微注射法,显微注射DNA的制备与纯化,DNA构型和末端结构载体DNA的长度与浓度溶解DNA的缓冲液DNA的纯度,鼠的准备与要求,转基因鼠实验所用各类鼠,超排卵与取卵,孕马血清（PMS）其有效成分为卵泡刺激素（FSH）。人绒毛膜促性腺激素（hGG）,雌鼠的排卵时间：PM10.0012.00雄鼠的排精时间：PM10.0012.00受精一般发生在：AM1.00,1 超排卵,制定排卵程序：(1)于第
31、一日中午先向小鼠腹腔内注入5一l 0单位的PMS；(2)过48小时(第三天中午)腹腔内注入510单位的人hCG(注射后1113 小时后排卵)；(3)令雌雄动物一对一的合笼交配；动物半夜交尾，如未发生交配，两周后可再重用，但成功率下降；(4)检查阴栓(第四日晨)；检查阴栓可判定是否受精；如已受精则出现阴栓。,2 受精卵的收集,(1)检查阴栓：有白色阴栓的小鼠可用，引颈处死动物：(2)取输卵管：剖开腹腔，取出输卵管，置入含有3ml培养液的60mm直径的瓶皿中；(3)取卵子；在20或50解剖镜下找到输卵管，在卵管膨大的壶腹部(于卵管开口近 处)隐约可见内含的胚卵，把胚卵团用尖摄轻轻压挤出，用吸管移入
32、含有400l分离 液的表玻皿中；(4)另准备45个瓶皿，每皿内均充有胚胎培养基400 l并覆盖有厚8mm硅烷油或液 体石蜡层(Fisher产，研究用)，硅烷油和石蜡巳预先在5%CO2中置371时做平衡 处理，覆硅烷油或石蜡层的目的是为防止培养液蒸发、散热和pH改变；(5)向含卵团表玻皿的分离液中加5 l新制备的透明质酸酶(透明质酸酶10mg1ml分 离液，Sigma产)，把胚卵团消化分散开；(6)当卵团散开后，立即把分散游离的卵细胞用吸管转移入培养皿中，通过硅油层接 种入任一培养液小滴中)，以清除酶的继续作用；(7)再依次通过皿内其余培养液小滴，以继续除掉酶和摆脱碎片(碎片能堵塞吸管口)，此时
33、的卵己可用作DNA注射之用。,DNA显微注射,制备持卵管与注射针在火焰灯上将微玻璃管拉成中间较细的约510cm长的一段，其口径约80120m，用玻璃刀将其在离颈部2cm处切断，再把切口烧成如图形状，口径约15 m。将尖部移近火焰喷灯略加热，用镊子轻触尖部适宜位置，使变成如图所示角度。由拉针器制成，针的口径应低于1 m。,（1）硅烷油注入：取培养皿或表玻皿，注入已经过平衡处理过的液体硅烷油或石蜡（厚约5mm）；（2）加培养基：通过硅烷油或石蜡层向培养皿底接种培养液，以100l为单元的小滴 数个，各滴间相距1一2cm(视小滴多少而定)；（3）胚卵接种：吸取待受注射胚卵数个，通过油层分别接种入培养液
34、小滴中；（4）DNA准备：从Eppendorf管中取一份DNA后；用75%乙醇漂洗后，真空中干燥，重悬于注射缓冲液中(含1mgDNAml)，使其最终浓度为：0.050.5mg/ml；（5）于临注射前把DNA样品在Eppendorf 管中再离心一次(1200rpm，10分钟)，以消 除末溶解物，防止阻塞注射管口；（6）把待注射用的DNA装入注射管中；,2 DNA注射,（7）在显微镜下把支持吸管转移到培养液小滴中，选一健康胚卵；先吸少量培养 液，仅令充入吸管末端，然后吹出；在吸管保持负压状态下吸住胚卵，继 之把支持管调至皿底令胚卵靠于皿底面中央部；（8）调注射针至胚卵近处，先调显微镜焦点看清针尖，
35、然后通过透明带刺入胚卵 细胞膜内(小鼠胚卵直径约10m)，进而继续进针再刺入任一原核内（雄性原 核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象）。注射针刺入细胞内进行注 射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进行注射；注射细胞数量越多越好；（9）用支持吸管把已注射细胞移入另一培养小滴中，使之与未注射细胞分开；待 注射结束后，把所有细胞均移入培养液中，置入温箱培养30分种；（10）镜下观察细胞，发现有溶解死亡崩溃者弃掉。,体内接种,（1）在手术前夜令受体母鼠与已结扎输精管雄性小鼠合笼，次日晨取出雌鼠备用；（2）取注射吸管两支，分别作为向两侧输卵管注入胚卵之用；先吸入少许培养液，排出
36、后留少许液体并保留一两个气泡，继之吸入胚卵数个(在管腔内成串)；最后仍保留一个气泡，以使管内胚卵限制于气泡之间不易移动并利于识别；,（3）麻醉小鼠，深度适当，置动物于小手术平台上，呈腹卧位(背朝上)；（4）剪出背肾部两侧毛，碘酒酒精消毒；（5）使动物躯干部一侧斜向上，在髂骨和肾脏下方间剪一纵切口，长2cm；（6）轻轻牵出输卵管，找寻输卵管口(刚排卵动物输卵管壶腹部微膨胀，内可见 成团未受精卵子)一手用镊子轻轻持住输卵管系膜，另一只手持一个含有胚 卵的注入管，伸入输卵管口内，把吸管内已含有外源DNA的胚卵全部注入 输卵管内；（7）把输卵管及周围组织送回腹腔内；（8）仔细紧密缝合创口，（9）再令动
37、物倒向另侧；按同样操作方法向该侧输卵管内输入同等量的胚卵。,优点：转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何病毒基因组片段，绝对安全。缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位缺失等；需显微操作仪，技术性要求强。,胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。,它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。,胚胎干细胞方法,优点：基因转移效率大大提高，且能进行
38、定位基因转移。缺点：需要多代才能得到纯合的转基因动物，这对饲养成本高，产仔数较少的大型哺乳类动物来说，要获得转基因动物是一件需要大量资金投入的事情。,通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞,反转录病毒载体的工作原理：寄生在受体细胞中的重组病毒由于没有包装信号，能生产病病毒RNA和所有蛋白质，但不能包装成病毒颗粒；病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。,反转录病毒法,优点：能有效地将转基因整合入受体细胞的基因组内，单拷贝整合型；转基因整合后能稳定地遗传；整合机制相应明确，在TR区域内进行，不会破坏转基因结构 缺点：载量较小，一般只有8kb，可能会因
39、缺少必须的调控元件而影响转基因表达；尽管病毒载体被设计为复制缺陷型的，但在包装细胞的包装过程中，若与整合型辅助表达基因组发生同源重组，就有可能组装成野生型逆转录病毒颗粒，因此在构建具有商业价值的转基因动物时，一般使用受到限制。操作繁琐。,斑点杂交和PCR扩增Southern杂交Northern杂交表达产的检测,转基因动物的检测,四、转基因动物的应用,转基因动物转基因动物在生命科学基础研究中的应用转基因动物在医药研究领域中的应用转基因生物反应器,多莉,荧光小鼠,转基因山羊,转基因猪,转基因动物,1 转基因动物,从屠宰场杀掉的奶牛体内收集 卵母细胞，并使之在体外成熟用公牛精液对成熟卵母细胞进 行体
40、外受精；受精卵离心，浓缩卵黄；将欲导入的DNA微注射到桔前 核当中；对胚胎进行体外培养；利用非外科移植术将一个胚胎 植入发情的代孕母牛子宫内；对于代进行州A检测，确定是 否存在转人基因。,转基因牛的流程,转基因牛,转基因绵羊、山羊和猪,在山羊奶中生产ATT,转基因禽类,转基因鱼,2 转基因动物在生命科学基础研究中的应用,研究基因的结构与功能研究基因的组织特异性表达研究发育相关基因的表达与调控克隆在发育中起重要作用的基因基因多级调节系统的研究细胞功能研究,基因敲除（gene knock out），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然
41、后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分观察整体推测功能的三部曲思想相似。,基因敲除的技术路线如下：（1）构建重组基因载体（2）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内（3）用选择培养基筛选已击中的细胞（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。,3 转基因动物在医药研究领域中的应用,研究病毒性疾病研究建立人类疾病的转基因动物模型转基因动物与基因治疗生产天然活性药物蛋白,一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过
42、人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。,4 动物生物反应器,4.1 动物血液生物反应器,外源基因在血液中表达的转基因动物叫血液生物反应器。大家畜的血液容量较大,利用动物血液生产某些蛋白质或多肽等药物己取得了一定进展。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来,血细胞组分可通过裂解细胞获得。,外源基因在膀胱中表达的转基因动物生物反应器,叫动物膀胱生物反应器。膀胱尿乳头顶端表面可表达一组尿血小板溶素的膜蛋白,这
43、种蛋白在膀胱中表达具有专一性,而且它的基因是高度保守的,将外源基因插入5端调控序列中,就可以指导外源基因在尿中表达。,4.2 动物膀胱生物反应器,动物乳腺生物反应器利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物,指导外源基因在乳腺中表达,并从转基因动物的乳液中获取重组蛋白。,4.3动物乳腺生物反应器,4.3.1 动物乳腺生物反应器的优点,产品质量稳定产品成本低研制开发周期短无污染经济效益显著,在山羊奶中生产ATT,4.3.2 动物乳腺生物反应器的应用,高乳汁营养价值生产药用蛋白,4.3.3 动物乳腺生物反应器存在的问题（1）外源基因在动物体内的位点整合问题（2）乳蛋白基因表达组织特异性问题（3）目的蛋白的翻译后修饰问题（4）转基因表达产物的分离和纯化问题（5）转基因的技术与方法问题（6）伦理道德问题,转基因动物的低效性转入基因造成宿主基因突变问题转入基因的表达问题病毒转基因研究存在的问题转基因动物模型与预期不符问题乳腺生物反应器的问题社会问题,五 转基因动物研究存在的问题,
