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1、自然生态恢复过程中尾矿废弃地土壤微生物变化尚文勤1，朱利平1，孙庆业1*，杨林章21. 安徽大学生命科学学院，安徽 合肥 230039；2. 中国科学院南京土壤研究所, 江苏 南京 210008摘要：尾矿废弃地是一种人为的裸地，其自然生态恢复过程表现为典型的生态系统原生演替过程。尾矿废弃地自然生态恢复过程为人们了解生态系统发展过程中土壤微生物群落的变化提供了一个良好的机遇。该研究以2处（即，铜陵杨山冲尾矿废弃地和铜官山新尾矿废弃地）不同时期弃置的、处于3个演替阶段（原生裸地阶段、隐花植物结皮阶段和草本维管植物群落阶段）的铜尾矿废弃地为研究对象，利用传统培养法（稀释平板法）和分子生物学法（净DN
2、A含量法）相结合的手段对土壤微生物量和土壤微生物群落结构变化及其影响因素进行了调查。数据分析表明：随着尾矿废弃地上植物群落的形成和发展，尾矿废弃地水分含量增加、pH降低、土壤有机质和总氮质量分数提高；土壤微生物数量逐渐增加，维管植物群落下的尾矿废弃地中土壤微生物数量明显高于处于演替初期阶段的隐花植物结皮，高于裸地；不同演替阶段尾矿废弃地中土壤微生物群落结构表现为细菌（60.6897.45）放线菌（2.5039.13）真菌（0.050.82）；相关分析发现，尾矿废弃地土壤微生物量变化与基质的含水量、总氮和有机质质量分数呈正相关，而与pH变化呈负相关。研究结果表明，在尾矿废弃地自然生态恢复过程中，
3、伴随着植物群落形成、发展和基质理化性质的逐步改善，尾矿中土壤微生物也逐步恢复。关键词：铜尾矿；废弃地；原生演替；土壤微生物中图分类号：S154.3 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2008）02-0713-05尾矿（tailings）是矿石经粉碎、浮选精矿后余下的微粒状固体粉末，通常被堆放于尾矿库内，弃置后的尾矿库形成尾矿废弃地1。尾矿废弃地不仅占用大量土地，同时来自于尾矿废弃地的酸性废水对周围的生态系统造成严重破坏。尾矿废弃地的生态恢复不仅为恢复生态学理论和技术研究提供了良好的平台，也为人们研究生态系统演替过程中生物群落多样性演变以及基质物理、化学和生物学性质的变化过程提供了理
4、想的机遇。目前，尾矿废弃地生态恢复已成为生态学、环境科学和土壤学的热点问题之一2。铜尾矿废弃地是一种人为原生裸地，其自然生态恢复过程表现为典型的生态系统原生演替过程：弃置后的尾矿裸地表面首先形成以藻类、藓类占优势的隐花植物结皮（cryptogamic crust），而后草本维管植物定居并逐渐形成自然植物群落3。在生态系统发展过程中，土壤微生物通过影响土壤中养分动态、能量转化以及动植物群落结构而影响着生态系统发展的进程与方向。目前，关于尾矿废弃地自然生态恢复过程的研究主要集中于植物种类组成、植物群落类型及其演替、尾矿基质理化性质和酶活性的变化等方面4-8，对于尾矿废弃地中数量庞大、种类繁多的土壤
5、微生物研究仅涉及重金属与微生物多样性关系方面9-10，国外关于人为裸地生态系统发展过程中土壤微生物群落研究目前也仅涉及煤矿废弃地方面11-13。关于重金属尾矿废弃地生态系统发展过程中土壤微生物群落演替的研究国内外鲜见报道。研究上的不足导致了人们对包括尾矿废弃地在内的各类人为原生裸地生态系统发展过程中土壤微生物群落结构和功能多样性演替过程、特点等重要生态学理论问题的认识十分肤浅。铜陵是我国六大铜业基地之一，区内堆存在大量的铜尾矿废弃地，多数尾矿废弃地处于自然生态恢复状态。本研究以安徽铜陵铜矿区2处不同时间弃置的铜尾矿废弃地作为研究对象，探讨随着自然生态系统发展，尾矿废弃地中土壤微生物群落的组成及
6、数量方面所发生的变化，揭示自然生态恢复过程中铜陵铜尾矿土壤基因库总量特性及其与土壤微生物数量的分布、土壤理化性质的关系。1 材料与方法1.1 样品采集在铜陵杨山冲尾矿库（弃置16a）和铜官山新尾矿库（弃置6a）废弃地，根据植物群落的不同采集尾矿样本。杨山冲尾矿库采集样本包括木贼群落（YM）、白茅群落（YB）、中华结缕草群落（YJ）和无任何植物生长的裸地（YL），铜官山新尾矿库采集样本包括隐花植物结皮（TY）和无任何植物生长的裸地（TL）。 野外采样采用随机采样、多点混合的方法进行。用于理化性质分析和土壤微生物净DNA含量分析的每个尾矿样本由7个采样点采集的样品混合成1份样本，每种植物群落各采集
7、3份样本；各植物群落采集1份样本用于土壤微生物平板法记数，由21个随机采样点尾矿样混合而成；采集深度05 cm。理化性质分析用风干样本进行，微生物分析用新鲜冷藏样本。1.3 尾矿中土壤微生物总DNA的提取与计算参照Tsai14等报道的方法并作改动：取1 g经过筛的尾矿，置10 mL离心管中，加2 mL磷酸钠缓冲液（0.12 molL-1，pH8.0），混合，放30 摇床上，150 rmin-1，15 min。8 000 rmin-1，离心10 min。取沉淀，重复上述操作。取沉淀，加裂解液（0.15 molL-1 NaCl，0.1 molL-1 EDTA，pH8.0）1.5 mL和50 mgm
8、L-1的溶菌酶0.5 mL，混匀，37 水浴2 h，每2030 min摇一下。加裂解液（0.1 molL-1NaCl，0.5 molL-1Tris-HCl，pH8.0，10SDS）2 mL，反复冻融3次，8 000 rmin-1，离心15 min。取上清液与等体积酚/氯仿/异戊醇（25241）混合，8000 rmin-1，离心10 min。重复上一步操作。取水相与等体积氯仿/异戊醇（241）混合，8 000 rmin-1，离心10 min。取水相，加0.6倍体积的异丙醇，-20 冰箱过夜，10 000 rmin-1，离心20 min，弃上清液。用体积分数为70%的乙醇洗沉淀，收集沉淀溶解于pH
9、8.0的TE缓冲液，终体积100 L。采用紫外分光光度法以A260对DNA进行定量，根据公式dsDNA=50A260稀释倍数，计算DNA的浓度（单位为gmL-1），换算出每克干土提取DNA的量。1.4 尾矿中可培养土壤微生物的培养微生物培养基和分离方法为：细菌牛肉膏蛋白胨琼脂平板涂布法；真菌马丁氏培养基平板涂布法；放线菌高氏1号培养基平板涂布法15。1.5 尾矿样品理化性质测定含水量用烘干法测定，并以自然湿土为基数计算土壤水分百分含量；pH采用pH计测定(尾矿水= 1 g5 mL)；土壤有机质质量分数测定用重铬酸钾容量法；总氮质量分数通过凯氏定氮法测定16。1.6 数据处理实验数据用SPSS1
10、0.0统计软件分析，Duncan检验被用来进行多重比较(p 0.05)，双变量相关分析采用Pearson相关系数。2 结果与讨论2.1 尾矿理化性质的变化与无植物生长的尾矿裸地相比，位于植物群落（无论是高等维管植物还是隐花植物）之下的尾矿在含水量、pH、全氮、有机质均等方面得到明显改善（表1）。表1 铜尾矿废弃地表层的理化性质（n = 3）Table 1 Phisical and Chemical properties of the upper layerof copper mine tailings样品名称w(水分)/%pHw(全氮)/%w(有机质)/%YM8.581.58 bc7.690.
11、15 a0.0160.006 c0.870.15 aYB8.710.99 bc7.700.03 a0.0240.007 d1.620.06 bYJ6.011.85 b7.820.15 ab0.0110.000 bc1.170.77 abYL2.540.20 a8.010.17 b0.0050.001 ab0.920.12 abTY9.472.60 c7.820.07 ab0.0100.003 abc1.460.48 abTL2.750.64 a7.700.16 a0.0040.009 a0.920.10 ab注: 表中数据为平均数标准差; 同列内不同字母表示差异性显著(p 0.05)有植物定居
12、的尾矿含水量显著高于无植物定居的尾矿裸地，前者的含水量为后者23倍，其中由藻类和藓类混合形成的隐花植物结皮（TY）的影响更为明显，其含水量是同一尾矿库的尾矿裸地（TL）的3.4倍。隐花植物对尾矿含水量的影响主要与构成结皮层的生物所产生的有机物质有关，这些有机物质在尾矿的表面形成一层致密的、褐色的或黑色的、厚度25 mm的有机壳，该层有机壳能有效减少尾矿中水分的蒸发。同样，杨山冲尾矿库中高等植物生长区域（YM，YB和YJ）的尾矿含水量显著高于尾矿裸地（YL），这主要因为高等植物的定居、生长能减少太阳光的直接照射，降低表层温度，从而提高表层尾矿水分含量。所调查的2处尾矿废弃地的pH基本上为中性至微
13、碱性。在杨山冲尾矿库，植物群落下尾矿的pH值低于尾矿裸地，其中尾矿裸地pH（8.01）显著高于木贼群落（7.69）和白茅群落（7.70）下的尾矿。在铜官山新尾矿库，尽管隐花植物结皮下的尾矿与尾矿裸地的pH无显著性差异，但前者仍低于后者，说明隐花植物结皮的生长能够降低尾矿基质的pH。生长在尾矿废弃地上的植物对尾矿基质pH的影响可能与来自植被的有机质有关17。氮素在矿业废弃地生态恢复过程中具有特别的重要性。从表1可以看出，具有植物生长的尾矿废弃地中，无论是仅有藻类和藓类生长的隐花植物结皮处还是高等植物生长处，其总氮质量分数都高于无任何植物生长的裸地，表明植物在尾矿上的自然定居、生长有利于尾矿废弃地
14、中氮素的积累。隐花植物结皮层下的尾矿氮质量分数的增加还可能与隐花植物结皮中蓝藻的固氮作用具有密切关系，在干旱、半干旱沙漠区域的研究已经证实了这些固氮蓝藻在增加基质氮素方面的重要作用18-19。在有机质质量分数方面，除了木贼群落下尾矿有机质质量分数较低外，其他植物群落（包括隐花植物结皮）下的尾矿有机质质量分数都高于裸地。因此，植物的生长有利于尾矿废弃地中有机质的积累。管东生等20研究表明，尾矿来自矿石，其本身仅含有极少量养分，尾矿中养分的增加主要是来自植物凋落物，凋落物的分解直接导致了有机质、总氮和速效钾的增加。不同植物群落对尾矿废弃地有机质质量分数的影响可能主要与植物凋落物数量及凋落物组成、分
15、解等有关。2.2 尾矿中可培养土壤微生物数量变化细菌、放线菌、真菌是土壤三大类微生物，它们在土壤物质循环和能量转换过程中扮演重要角色。土壤微生物的结构和数量受多种因子影响，如温度、含水量、pH、养分状况、植物群落等。表2表明，在2处尾矿废弃地的土壤微生物组成中，细菌数量最多、放线菌的数量次之、真菌的数量最少，三者所占的比例分别为细菌60.6897.45、放线菌2.5039.13、真菌0.050.82。较高的细菌和放线菌数量可能与尾矿废弃地中性至碱性的pH有关。导致尾矿中真菌的数量较少的原因可能有以下两个方面：（1）尾矿的pH。有研究表明，有很多真菌只能在酸性pH范围内生长发育21，而尾矿的pH
16、值都在7以上，是不适合真菌生长的中性至碱性环境。（2）水分状况。水分是促使真菌良好地生长发育必不可少的条件，真菌数量与其最适的水分含量呈正相关，在最适水分以下，菌丝体减少，孢子增多。尾矿的含水量一般较低，可能对真菌的生长产生不利的影响。 表2 不同类型尾矿土壤总DNA和土壤微生物数量（n =3）Table 2 Total DNA and microbes in different type tailings样品名称w(DNA)/(gg-1)细菌/(104个g-1)放线菌/(104个g-1)真菌/(103个g-1)微生物总数/(104个g-1)YM6.990.53c42.769.53 c14.3
17、80.55 c0.960.69 b57.2810.10 bYB4.361.05b40.964.54 bc19.640.97 d1.571.01 b60.761.44 bYJ4.211.33b33.7613.42 b21.773.68 d1.050.77 ab55.642.23 bYL0.490.21a5.151.03 a0.960.06 a0.340.29 a6.151.06 aTY4.240.77b5.811.16 a3.430.25 ab0.600.15 ab9.300.96 aTL0.400.46a9.163.40 a4.510.45 b1.130.13 ab13.793.01 a注(N
18、otes): 以干尾矿计, 表中数据为平均数标准差; 同列内不同字母表示差异性显著(p YBYJYL，这一顺序与前面通过经典方法所得顺序基本是一致的；在铜官山新尾矿废弃地，隐花植物结皮下的尾矿中土壤微生物净DNA含量显著高于裸地，尽管与传统方法的结果不一致，但我们认为利用土壤净DNA含量能够更好的反映土壤微生物总量。相关分析表明，样本中微生物DNA质量分数与含水量、全氮质量分数、有机质质量分数呈一定的正相关关系，与pH呈负相关关系，其中微生物DNA质量分数与尾矿废弃地的含水量的相关性达到显著的水平，其相关系数是0.872（p 放线菌数量真菌数量。（2）尾矿废弃地土壤微生物生物量变化与基质的含水
19、量、总氮和有机质质量分数以及pH变化密切相关。参考文献：1 田胜尼, 刘登义, 王峥峰, 等. 铜尾矿对5种豆科植物根系生长的影响J. 生态环境, 2005, 14(2): 199203.Tian Shengni, Liu Dengyi, Wang Zhengfeng, et al. Effects of copper tailings on the growth of roots of five legume speciesJ. Ecology and Environment, 2005, 14(2): 199-203.2 卫智军, 李青丰, 贾鲜艳, 等. 矿业废弃地的植被恢复与重建J.
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39、anjing 210008, ChinaAbstract: Copper mine tailings wastelands are a kind of man-made barren. The ecosystem development on the tailings wastelands is a primary succession, which provides a good opportunity for understanding the changes of soil microbial communities during the primary ecosystem succes
40、sion. In order to investigate the succession of soil microbial community with ecosystem development, soil samples of three successional stages (i.e., barren stage, cryptogamic crust stage and herbaceous vascular plant community stage) from two tailings wastelands (Yangshanchong tailings wasteland di
41、scarded in 2001 and New Tongguanshan tailings wasteland discarded in 1991) were collected and soil microbial biomass was determined by methods of typical plate culture and molecular biology (net DNA content). The data analysis showed that the content of water, soil organic matter and total nitrogen
42、in tailings wastelands increased with formation and development of plant communities. However, pH value of tailings wastelands decreased with ecosystem development. The change of soil microbial biomass at different successional stages displayed the following order: barren stage cryptogamic crust sta
43、ge actinomyces (2.5039.13) Fungi (0.050.82). The correlation analysis indicated that soil microbial biomass was positively correlated to contents of water, soil organic matter and total nitrogen in tailings wastelands and was negatively correlated to pH value of tailings wastelands. It can be concluded that soil
