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1、1,定量PCR基本原理及方法,基因有限公司 黄妤,2,荧光定量PCR基本原理荧光定量PCR标记方法荧光定量PCR不同方法学的应用,内容,3,定量PCR技术的产生1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB加入PCR反应体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度核酸 染料荧光后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB,荧光定量PCR基本原理,4,Real-time Chemistries,PCR的理论方程：Y=x(1+Ev)n Y：扩增物数量；X：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数,1.终点法定量原理前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同原理
2、：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即：lnx=lnY-nln(1+Ev)=lnY-b(b为常数)2.实时检测法定量原理前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgYnLg(1+Ev)=b-na(a、b为常数),荧光定量PCR的定量原理,5,n:扩增循环数的确定,6,logN=log N0+nlogE n=Ct每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。,Ct值与起始模
3、板的关系,Y轴Ct值,X起始拷贝数的对数,7,标准曲线由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线计算待测样品的初始模板浓度,log N0=-Ct logE+logN,绝对定量未知浓度的样品与标准曲线相比较,8,内掺式染料 SYBR Green I,LC Green 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons FRET 引物特异性探针Amplifluor(Intergen)LUX,荧光定量 PCR 标记方法,9,内掺式染料 SYBR-Green I,10,内掺式染料 SYBR-Green I,11,双标记探针（Taqman Probe）,12,X,分子信标（Molecular B
4、eacon Probe）,13,Oligo 1:Fluorescein,Oligo 2:LC Red 640,荧光共振能量传递（FRET Probe）,14,荧光定量PCR不同方法学的应用,研究目的 标记方法,15,定量分析（基因拷贝数的绝对定量，基因表达调控的相对定量）Sybr-Green(LC Green),Taqman,Molecular Beacon,etc,研究目的,基因型分析（SNP、突变型分析）Taqman,Molecular Beacon,FRET,LC Green,熔解曲线分析 Sybr-Green,LC Green,Molecular Beacon,FRET,16,某科研用
5、户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达检测结果（自备标准品，检测样品做复管）,绝对定量,17,某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分析，下图为用Ct法得出的分析结果。（自备标准品，检测样品做3次重复复管）,HouseKeeper Gene,Gene of Interest,相对定量,18,利用溶解曲线进行实验条件的优化（RG3000）,熔解曲线分析,Annealing at 60,Annealing at 63,19,标记方法,Taqman 定量分析，基因型分析,Sybr-Green 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析(LC Green),Molecula
6、r Beacon 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析,FRET 定量分析，熔解曲线分析，基因型分析,Ampliflour Probe，LUX 定量分析,20,基因型分析,利用扩增信号的种类来分型 Taqman根据熔解曲线的不同来分型 FRET,Molecular Beacon LC Green,21,双Taqman探针法检测野生型和突变型 在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野生型和突变型)，即一个突变型探针以一种荧光素（Flr）标记，而野生型探针则用不同的荧光物（Tet）标记。如果只有一种信号被扩增出来，则样本为对应的基因型（野生型或突变型）的纯合子；如二者都被有效地扩
7、增出来，则样本为杂合型。,利用扩增信号的种类来分型,杂合型,野生型,突变型,22,FRET探针进行熔解曲线分析确定基因型 FRET探针与模板结合时，因共振能量的传递而信号增强，而当在Tm 值时，FRET探针与PCR产物分开，荧光信号减弱。通过实时捕捉到的PCR产物在熔解过程中荧光信号的变化，得到PCR产物的熔解曲线。因为发生基因突变的PCR产物有特定的Tm 值，通过测定探针与PCR产物分开时的熔解温度Tm值，就能确定样品的基因型。,利用熔解曲线检测基因突变,杂合型,野生型,突变型,23,利用内掺式染料进行高分辨率熔解曲线（HRM）分析基因型HRM根据序列长度、GC含量和互补性分析样品，可精确到单碱基差异。相比其它方法节约了探针和标记的费用。,上图：用内掺式染料（无探针）区分ACTIN3（R577X）SNP基因型（C到T替代）。同源野生型、突变型及杂合样品如图所示（10次重复），由随机软件自动分型。片段预先进行40个循环的快速扩增（40分钟）。,利用熔解曲线检测基因突变,24,谢谢！,专才服务专家,
