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1、2023/3/3,1,实验八：逆境对植物生理生化指标的影响（脯氨酸及相对电导率）,（一）实验目的及意义（二）实验原理（三）实验步骤（四）实验报告,2023/3/3,2,实验目的和意义,本实验设计主要通过培养植物的幼苗，给予幼苗不适宜的干旱胁迫处理，来研究植物对逆境的反应，通过测定幼苗的膜透性、脯氨酸含量的变化，研究逆境对植物生长的影响及植物内部的生理生化机理。,2023/3/3,3,实验原理,脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因此脯氨
2、酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内，脯氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。,2023/3/3,4,实验原理,正常情况下，植物体内脯氨酸含量并不高，但遭受水分、盐分等胁迫时体内的脯氨酸含量往往增加，它在一定程度上反映植物受环境水分和盐度胁迫的情况，以及植物对水分和盐分胁迫的忍耐及抵抗能力。植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物，该产物在520nm有一最大吸收峰，其色度与含量正相关，可用分光光度法测定。该反应具有较强的专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物，碱性氨基酸对这一反应有干扰，
3、但加入人造沸石（permutit），在PH 17范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸，精氨酸等2氨基的氨基酸）。,2023/3/3,5,实验原理,植物细胞膜起调节控制细胞内外物质交换的作用，它的选择透性是其最重要的功能之一。当植物遭受逆境伤害时，细胞膜受到不同程度的破坏，膜的透性增加，选择透性丧失，细胞内部分电解质外渗。膜结构破坏的程度与逆境的强度、持续的时间、作物品种的抗性等因素有关。因此，质膜透性的测定常可作为逆境伤害的一个生理指标，广泛应用在植物抗性生理研究中。当质膜的选择透性被破坏时细胞内电解质外渗，其中包括盐类、有机酸等，这些物质进入环境介质中，
4、如果环境介质是蒸馏水，那么这些物质的外渗会使蒸馏水的导电性增加，表现在电导率的增加上。植物受伤害愈严重，外渗的物质越多，介质导电性也就越强，测得的电导率就越高（不同抗性品种就会显示出抗性上的差异。）本实验采用电导率法测定电解质的相对外渗率，来了解干旱情况下植物受害的程度。,2023/3/3,6,实验材料和器材,器材：分光光度计、水浴锅、烘箱、天平、带塞试管、烧杯、研钵、石英砂、漏斗、滤纸、玻棒、电导率仪 试剂：80%乙醇、酸性茚三酮试剂、脯氨酸标准母液、人造沸石、活性碳,实验材料绿豆苗,2023/3/3,7,实验步骤,分别吸取上述各标准溶液2mL，冰醋酸2mL，茚三酮试剂2mL，加入到10mL
5、带塞刻度试管中，塞上塞子，于沸水浴中加热15分钟，用分光光度计测定520nm的光密度值，以零浓度为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标制作标准曲线。,1脯氨酸标准曲线制作：吸取脯氨酸标准母液0,0.5,1.25,2.5,5.0,7.5,10.0,15.0mL分别放入8个50mL容量瓶中，分别加入蒸馏水定容至50mL，配成0.0，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，30.0g/mL的系列溶液。,2023/3/3,8,实验步骤,(2）除去干扰的氨基酸：向提取液中加入约0.4g的人造沸石和0.2g活性碳，强烈振荡5分钟，过滤，滤液备用。（3）脯氨酸含量的测定
6、：分别吸取上述提取液2mL于刻度试管中，再取一支刻度试管，加入2mL 80%乙醇作为参比，分别向上述各试管中加入2mL冰醋酸和2mL茚三酮试剂，沸水浴中加热15分钟，冷却后在分光光度计测520nm处各样品的光密度，从标准曲线上查出每毫升被测样品液中脯氨酸的含量,2样品中脯氨酸的提取及测定:（1）提取脯氨酸：各取正常和干旱处理的绿豆苗的叶片0.3g，剪碎，加入适量80%乙醇，少量石英砂，于研钵中研磨成匀浆。匀浆液全部转移至10mL刻度试管中，用80%乙醇洗研钵，将洗液移入相应的刻度试管中，最后用80%乙醇定容至刻度，混匀，80水浴中提取20分钟。,2023/3/3,9,实验步骤,2、测定电导率R
7、1，称重。3、把烧杯连材料放进微波炉里中火煮5分钟，再称重，补去离子水至原重。4、测定电导率R2。5、计算相对电导率。,相对电导率的测定1、称取正常和干旱处理的绿豆苗的胚轴各1.0g，先用自来水冲洗去除表面的污物，再用无离子水冲洗2次。用吸水纸吸去多余的水分。将材料切成1厘米长度的小段，放进加了20ml的去离子水的烧杯里面，室温下浸泡1h。,2023/3/3,10,实验报告,1根据实验结果，分析盐分胁迫与植物体内游离脯氨酸积累之间有何关系？2为什么用茚三酮作显色剂要在酸性条件下起反应？目的是什么？3相对电导率与细胞膜的透性之间有怎样的关系？4相对电导率能否作为 植物抗寒（冻）性的生理指标？为什么？5 以电导率或相对电导率作为抗寒性的指标，哪个更好些？为什么？,
