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1、对微生物进行培养，生产有用物质的过程就是发酵。采用微生物发酵生产药物就是微生物发酵制药。,第一节 概述,一、微生物发酵制药的发展历史,微生物发酵制药的历史悠久。但直到第二次世界大战初期，人们认识到抗生素特别是青霉素重要性以后，才大大推动微生物制药工业的发展。液体深层发酵技术、细胞融合技术、基因工程技术的出现，又为微生物发酵制药带来新的发展空间。,二、微生物发酵制药的研究范围,1、微生物菌体发酵：获得具有药用菌体为目的的发酵。,2、微生物酶发酵：获得药用酶为目的的发酵。,3、微生物代谢产物发酵：获得微生物具有药用的各种初级产物和次级产物为目的的发酵。,4、微生物转化发酵：利用微生物发酵过程中的转
2、化作用生产药物。,微生物转化就是利用微生物细胞中的一种酶或多种酶将一种化合物转变成结构相关的另一种产物的生化反应。,三、微生物发酵药物的分类,微生物药物有抗生素，维生素，AA，核酸有关物质，有机酸，治疗酶，酶抑制剂，激素，免疫调节物质以及其他生理活性物质。,四、制药微生物,1、制药微生物的种类,生产药物的天然微生物主要包括细菌、放线菌和丝状真菌三大类。细菌主要生产环状或链状多肽类抗生素；放线菌主要产生各类抗生素；真菌的曲霉菌属产生桔霉素，青霉素菌属产生青霉素和灰黄霉素等，头孢菌属产生头孢霉素等。,2、制药微生物菌种的选育,主要有：自然选育、诱变育种、杂交育种、基因工程技术育种四种。,自然选育：
3、在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫自然选育或自然分离。自然选育的常用方法是单菌落分离，需要反复筛选，确定生产能力比原菌株高的菌种。基本过程：菌种单孢子或单细胞悬液适当稀释琼脂平板分离挑单个菌落进行生产能力测定选出优良菌株。,3、菌种保存,目的：保持长期存活、不退化、不丧失生产能力。保存原理：使其代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态，可保持原有特性，延长生命时限。,（1）斜面低温保存,保存方法：,（2）液体石蜡密封存保藏,（3）砂土管保藏,（4）冷冻干燥保藏,（5）液氮低温保藏,第二节 发酵过程及其优化控制,一、发酵制药的基本过程,菌株选育（m
4、utation and selection breeding）发酵(fermentation)分离纯化(isolation and purification),包括三个主要工段：,1、生产菌种选育 优良菌种应该高产、性能稳定、容易培养。,2、发酵阶段 包括孢子制备、种子制备、发酵培养，是生物加工工程过程。,3、分离纯化阶段 包括发酵液处理与过滤、分离提取、精制、成品检验、包装、出厂检验，是化学分离工程过程。,二、发酵工艺条件的优化控制,（一）、培养基及其制备,1、培养基的成分,（1）、碳源,凡是构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称为碳源。其主要作用是供给菌种生命活动所需要的能量；构成菌
5、体细胞成分和代谢产物。在药物发酵生产中常用的碳源有：糖类、醇类、脂肪、有机酸等。,（2）、氮源,凡是构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质均称为氮源。其主要功能是构成微生物细胞物质和含氮代谢物。可分为有机氮源和无机氮源两类。常用有机氮源有黄豆饼粉（最常用）、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、尿素等。,常用无机氮源有铵盐、氨水和硝酸盐。,（3）、无机盐及微量元素,无机盐和微量元素是生理活性物质的组成成分或具有生理活性作用的调节物，包括磷、硫、铁、镁、钙、锰、铜、锌、钴、钾、钠、氯等。一般低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。,菌体细胞的主要成分，营养传递的介质。调节细
6、胞生长环境温度。,（4）、水,消除泡沫，防止逃液和染菌。一般为动植物油脂和高分子化合物。,（5）、消沫剂,生长因子是指微生物生长不可缺少的微量有机物，包括氨基酸、维生素、核苷酸、脂肪酸等。,（6）、生长因子,在药物的生物合成过程中，被菌体直接用于药物合成而自身结构无显著改变的物质称为前体。前体明显提高产品产量和质量，一定条件下还能控制菌体合成代谢产物的方向。,（7）、前体与促进剂,促进剂是指那些既不是营养物又不是前体，但能提高产物产量的添加剂。,2、培养基的种类,按组成分为：合成培养基(synthesized medium)天然培养基(natural medium)半合成培养基(semi-sy
7、nthesized medium),按用途分为：选择性培养基(selective medium)鉴别性培养基(identification medium),按物理性质分为：固体培养基(solid medium)半固体培养基(semi-solid medium)液体培养基(liquid medium),按发酵过程中所处位置和作用分为：,斜面或平板固体培养基（solid medium）,种子培养基（seed medium）,发酵培养基(fermentation medium),补料培养基(fed medium),(1)斜面或平板固体培养基（solid medium）,包括细菌和酵母的固体斜面或平板
8、培养基，链霉菌和丝状真菌的孢子培养基。作用:提供菌体的生长繁殖，形成孢子。特点:菌体生长迅速，产生优质大量的孢子，但不能引起变异，营养丰富。,（2）、种子培养基（seed medium）种子培养基是供孢子发芽和菌体进一步生长繁殖的培养基，包括摇瓶和一二级种子罐培养基，为液体培养基。作用:使种子扩大培养，增加细胞数目，生长形成强壮、健康和高活性的种子。特点：培养基成分完全，营养丰富，含有容易利用的碳、氮源和无机盐等，但总体浓度高。,（3）、发酵培养基(fermentation medium)发酵培养基是提供微生物进行目标产物的发酵生产的培养基，不仅要满足菌体的生长和繁殖，还要满足菌体合成目标产物
9、，是发酵生产中最关键和最重要的培养基。作用：供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物。特点：组成应丰富完整，营养成分浓度和粘度适中。,（4）、补料培养基(fed medium)补料培养基是发酵过程中添加的培养基。作用：稳定工艺条件，延长发酵周期，提高目标产物产量。特点：一般按单一成分配制，在发酵过程中各自独立控制加入，或按一定比例制成复合补料培养基，再加入。,3、影响培养基质量的因素,（1）、原料质量,（2）、水质,（3）、灭菌,（4）、培养基的黏度,（二）、温度对发酵的影响及其控制,1、温度对发酵的影响,发酵温度对菌体生长和产物的合成的影响存在一个最适温度范围和最佳温度点，偏离一定范围，生长会受到抑
10、制，各种酶的反应速率和产物的性质也会受到影响。温度对培养基发酵液的物理性质也有很大影响，通过影响黏度、溶解氧、传递速率等影响发酵动力学和产物的生物合成。,2、影响发酵温度变化的因素,发酵过程中的最终能量变化决定了发酵温度，包括产能因素和失能因素的共同作用。发酵热（fermentation heat）等于产生热(production heat)与散失热(loss heat)之差，产生热包括生物热(biological heat)和搅拌热(agitation heat)，散失热包括蒸发热(evaporation heat)、显热(sensible heat)和辐射热(radiant heat)。Q
11、热Q生Q搅Q蒸Q显Q辐,3、温度的控制,（1）最适温度的选择 根据发酵不同阶段对温度的不同要求，选择最适温度并进行变温控制下的发酵，以期高产。,（2）温度的控制 大型发酵罐一般不需要加热，因为发酵中产生大量的发酵热，往往经常需要降温冷却，控制发酵温度。给发酵罐夹层或蛇形管通入冷却水，通过热交换降温，维持发酵温度。,（三）、pH的影响及其控制,1、pH的影响,改变了细胞膜的透性，影响了物质的吸收和产物的分泌。,2、影响pH变化的因素 发酵液的pH变化是菌体产酸和产碱的代谢反应的综合结果，它与菌种、培养基和发酵条件有关。培养过程中菌体对碳源、氮源物质的利用也是造成培养体系pH变化的重要原因。,3、
12、pH的控制,（1）培养基配方考虑。均衡使用产酸物质、产碱物质及使用缓冲剂，保证碳氮比平衡。,（2）酸碱调节。常用生理酸性物质如硫酸铵和生理碱性物质氨水来控制，不仅调节了pH，还补充了氮源。,（3）补料流加控制。一种是直接补加酸碱物质，另一种方法是通过控制代谢途径实现pH控制.,（4）调节通气量。,（四）、溶解氧影响与控制,溶解氧（dissolved oxygen,DO）是指溶解于培养液中的氧。溶解氧浓度由供氧和需氧两方面所决定，供氧(oxygen supply)是指氧溶解于培养液的过程。菌体吸收溶解氧的过程是耗氧（需氧）过程。不同菌种对溶解氧量的需求是不同的，有一个适宜的范围，必须通过试验确定
13、临界氧浓度和最适氧浓度，并在发酵中维持最适氧浓度。临界氧浓度：不影响呼吸或产物合成的最低溶解氧浓度。,溶解氧控制,直接提高溶解氧：增加氧传递推动力和通气速率等。间接控制溶解氧：控制菌体浓度。,工艺控制方法：控制补料速度，调节温度（降低），培养基（配方，液化，降低粘度），中间补水，添加表面活性剂（消沫剂种类及数量次数时间）。,（五）、CO2的影响及其控制,1、CO2对发酵的影响,CO2对微生物生长或发酵具有刺激或抑制作用，还影响培养基的酸碱平衡。CO2对细胞的影响机理：直接影响细胞膜的结构，从而影响细胞的形态和生理过程。,与其他物质发生化学反应，或与生长必需的金属离子形成碳酸盐沉淀，间接影响菌体
14、的生长和发酵产物的合成。,2、CO2浓度的控制,通气和搅拌是控制CO2浓度的一种方法。降低通气量和搅拌速率，有利于增加CO2在发酵液中的浓度，反之，就会减小CO2浓度。另外，CO2的产生与补料工艺控制密切相关，如：青霉素发酵时，补糖会增加排气中CO2浓度和降低培养液的pH。,（六）、补料的作用和控制,1、补料和放料 补料（fill）：间歇或连续的补加一种或多种成分的新鲜培养基就是补料。放料（wihtdraw）：发酵到一定时间，产生了代谢产物，放出一部分发酵液（进行提取），又称带放。补料、放料的作用在于：补充营养物质；改善发酵液流变学性质；调控培养液的pH；解除基质过浓的抑制、产物的反馈抑制和葡
15、萄糖分解阻遏效应；避免在分批发酵中因一次性投糖过多造成细胞大量生长、耗氧过多而供氧不足的状况。,2、补料控制系统（1）、反馈控制系统 由传感器、控制器、驱动器组成。依据溶氧、pH、呼吸熵、排气中CO2分压，代谢产物浓度等指标直接控制。（2）、非反馈控制系统 非反馈控制流加系统是不通过固定的反馈控制参数，而通过经验或数学最大优化模型法，得到最优流加操作曲线，从而实现流加控制。,（六）、泡沫的影响及其控制,1泡沫的影响,减少装料量；造成大量逃液，增加污染的机率；泡沫使菌体呼吸受阻，代谢异常或自溶。,2泡沫控制（1）培养基与工艺调整。调整培养基的成分，少加或缓慢加易起泡的原材料；改变某些物理化学参数
16、，如pH，升高温度，减少通气和降低搅拌速率；改变发酵工艺，如采用分次投料。（2）菌种选育。筛选出不产生流态泡沫的菌种。（3）机械消沫（mechanical defoaming）。利用机械强烈振动或压力变化而使泡沫破裂。（4）化学消沫。加入消沫剂(defoaming agent)，降低泡沫的液膜强度和表面黏度，使泡沫破裂。常用的消沫剂有天然油脂类(lipid)、高碳醇脂肪酸(high alcohol fatty acid)和酯类(ester)、聚醚类(polyether)、硅酮类(silicone)。,（七）、发酵终点的判断,判断原则：高产量、低成本。以原料和发酵成本占整个生产成本为主的药品，主
17、要在于提高产率（单位体积、单位时间内的产量，kg/(hm3)）、得率（转化率，单位原料生产的产物量，kg产物/kg原料）、发酵系数（单位发酵周期内的发酵体积生成的产物，kg产物/(容积m3周期h)）。,影响发酵终点判断的因素：,1经济因素发酵终点应是最低成本获得最大生产能力的时间。,2产品质量,3.生物、物理、化学指标主要产物浓度、过滤速度、菌体形态、氨基氮、pH、DO、发酵液的外观和粘度等。,4、特殊因素如染菌、代谢异常等情况。,三、灭菌操作技术,杂菌（contaminated microbe）：对于发酵生产过程，除生产菌以外的任何微生物。,污染（contamination）：感染杂菌的发酵
18、体系。,消毒(disinfection)：指用物理或化学方法杀灭或清除病原微生物（pathogen），达到无害化程度的过程，只能杀死营养体，而不能杀灭芽孢体，杀灭率99.9%以上。,灭菌（sterilization）：指用物理或化学方法杀灭或清除物料或设备中所有生命物质的技术或工艺过程，达到无活微生物存在的过程，微生物杀灭率99.999999%以上。,（一）、常用灭菌方法与原理,1、化学灭菌,化学灭菌是指用化学物质杀灭生物细胞的灭菌操作。常用化学灭菌剂有氧化剂类、卤化物类、有机化合物等。灭菌原理：使蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性，细胞死亡。,2、辐射灭菌,各种物理射线对生物细胞具有杀伤能力
19、，其中以紫外线最常用。灭菌原理：核酸和蛋白质在紫外区有强烈的吸收，DNA吸收紫外线后，会形成嘧啶二聚体，如胸腺嘧啶二聚体，分子之间的交联改变了DNA的功能，从而导致生物细胞死亡。,3、干热灭菌,灭菌原理：在高温120以上，蛋白质、酶、核酸、生物膜等生物大分子变性、凝聚破坏，甚至是降解，生物细胞破裂，内容物释放，生物体死亡。,足够长的时间和足够高的温度，可以杀灭生物体。,干热 热空气,烘箱,160170 2h灭菌,（4）湿热灭菌,蒸汽灭菌锅,121 2030min,湿热水蒸汽,灭菌原理：蒸汽冷凝时释放出大量能量，使蛋白质、核酸等内部的化学键破坏、降解，导致生物体死亡。,在115140，保持一段时
20、间，可以杀死各种生物体。,5、培养基的过滤除菌 有些培养基成分受热容易分解破坏，不能使用蒸汽灭菌，常常采用过滤器除菌。常见的有蔡氏细菌过滤器、烧结玻璃细菌过滤器和纤维素微孔过滤器等。,（二）、无菌检查与杂菌控制,1、无菌试验方法与染菌的判断,杂菌检测的主要方法为显微镜检测和平板划线检测两种，显微镜检测方便快速及时，平板检测需要过夜培养，时间较长。,2、发酵污染杂菌的原因,（1）培养基灭菌不彻底,（2）空气带菌,（3）设备及其附件渗漏,第三节 发酵工程生产药物,细菌抗菌素：多粘菌素，短杆菌素等 植物抗生素：蒜素，番茄素，黄连素C等 动物抗生素：溶菌酶，鱼素等。,抗生素：（antibiotics）
21、,抗生素是生物在其生命活动过程中产生的，在低微浓度下能选择性地抑制他种微生物机能的化学物质。,一、抗生素生产工艺,1928年，英国细菌学家Fleming在培养葡萄球菌时，发现污染在培养皿上的一株霉菌，能杀死周围的葡萄球菌。将此霉菌分离后得到的纯菌株，经鉴定为点青霉(Penicillium notatum)，将该菌产生的抗生物质命名为青霉素。,（一）、抗生素工业发展,1940年，Florey and Chain将青霉素制成制品，经临床试验，证明青霉(Penicillin)毒性很小，对金黄色葡萄球菌及其他G+所引起的许多严重疾病确有卓越的疗效。1943年，开始采用通气搅拌深层发酵技术生产青霉素，从
22、此发展了一个新的工业部门抗生素发酵工业。,1944年，WaKsman发现了由链霉菌产生的链霉素，用于治疗细菌，特别是对结核杆菌引起的感染有特效。此后陆续发现了抗G-、G+抗病毒的广谱抗生素，如氯霉素（1947年）、金霉素（1948年）和土霉素，抗真菌的制霉菌素，对青霉素耐药菌有效的红霉素（1951年）及抗癌抗生素丝裂霉素C等。,1959年，Batchelor获得了青霉素母核-6-氨基青霉烷酸，并研究了半合成青霉素和头孢菌素C，得到耐酸、可口服并对青霉素耐药菌有效的广谱青霉素。,60年代，半合成抗生素迅速发展。,1957年，华北制药厂。1958年后，全国多处建厂，抗生素工业迅速发展。截止到199
23、6年上半年，我国开发的抗生素品种127个。国外有的基本抗生素品种我国都有生产。并已研制出国外没有的抗生素创新霉素等。,我国1953年，建上海第三制药厂，开始生产青霉素。,（二）、抗生素的抗菌作用机理,抗生素的抗菌作用，主要是抑制微生物细胞新陈代谢的某些环节或某些酶系统。依照这些代谢环节在生活机能上的重要程度，抗菌作用的效果各不相同。,放线菌素D特异地与双链DNA非共价结合，使之失去作为RNA合成的模板功能。丝裂霉素C与DNA形成交联，阻止了双链的拆开因而抑制了DNA的复制。利福平：依赖于DNA的RNA聚合酶的特效抑制剂，专门抑制转录的起始。,1、抑制核酸的合成,有些抗生素可抑制核酸的合成，其抑
24、制机理是多种多样的。,2、抑制蛋白质的合成,包括抑制氨基酸的活化、抑制蛋白质合成的起始、抑制肽链的延长、抑制蛋白质合成的终止。,（1）抑制氨基酸的活化,吲哚霉素与Trp 竞争与Trp激活酶结合抑制了Trp-tRNATrp的形成，因而阻止了蛋白质的合成。,Trp,抑制氨酰-tRNA 的形成,（2）抑制蛋白质合成的起始,起码密码：AUG 编码 Met(真核)fMet(原核)COOH-CH-CH2-CH2-SCH3 NH O=CH fMet-N-甲酰甲硫氨酸,（3）抑制肽链的延长,肽链的延长包括氨酰-tRNA与70S核糖体A部位的结合，肽键的形成和移位。,终止密码：UAA、UAG、UGA 终止过程：
25、终止信号的识别，完工了的肽酰-tRNA的水解与释放。如嘌呤霉素与AA-tRNA 3-末端(tRNA 3-ccA)AMP结构相似，肽酰转移酶促使(AA)n与嘌呤霉素结合形成肽酰-嘌呤霉素复合物，使Pr合成过程中止。,(4)抑制蛋白质合成的终止,如多肽类抗生素、多粘菌素E、短杆菌肽S等都具表面活性剂的作用，降低细菌细胞膜的表面张力，因而改变了细胞膜的通透性，甚至破坏了膜的结构，影响细胞正常代谢，致使细菌死亡。这类抗生素靠损伤质膜而呈杀菌作用，它们对人和动物细胞膜也起作用，选择性毒力不高。,3、改变细胞膜的通透性,青霉素、头孢菌素、杆菌肽等对细菌细胞壁合成具有抑制作用。青霉素专门作用于生长时期的细菌
26、，抑制新的细胞壁的形成，细胞壁的合成受到抑制后，细菌的抗渗透压能力降低，引起菌体变形、破裂而死亡。动物细胞无细胞壁，因此青霉素对其无副作用。,4、干扰细胞壁的形成,如抗霉素A是呼吸链电子传递系统的抑制剂，它抑制细胞色素b与细胞色素c1之间的电子传递。(NADH FMN CoQ Cytb Cytc1 CyTc Cyta1a3 O2),5、作用于能量代谢系统或作为抗代谢物,抗代谢物：在结构上与生物体所必需的代谢物很 相似，以致可以和特定的酶结合，从 而阻碍酶的功能，干扰代谢的正常进 行。,抗生素使用剂量不足，则达不到抑菌能力；但剂量过高，会产生毒副反应，并引起病原菌的耐药性。,（三）、抗生素剂量表
27、示法,一个青霉素效价单位：能在50ml肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的最小青霉素剂量。一个链霉素效价单位：能在1ml肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌（G-）发育的最小剂量。,效价单位为衡量抗生素的一种尺度。,一个制霉素效价单位：能抑制1ml肉汤培养基中某种酵母菌发育所需的最小剂量。新发现的抗生素，初期未得到纯晶体时常用与它性质相近的已知抗生素作为标准来衡量其效价。,工艺流程:,（四）、抗生素生产工艺,菌种的保藏 孢子制备 种子制备,发酵,提取,精制,抗生素的工业生产包括发酵和提取两部分。,例：青霉素的生产工艺,（五）、细菌对抗生素耐药性机理,1、耐药菌产生导致抗生素失效的酶,（1）
28、-内酰胺环被破坏,（2）乙酰化导致氯霉素失效,还有通过对抗生素磷酸化，腺苷酰化或N-乙酰化导致其失效。,例如菌体核糖体的30S亚基改变而使链霉素不能与之结合，就不能抑制蛋白质的生物合成而失效。链霉素抑制蛋白质合成的起始。耐利福霉素的菌株，由于染色体突变，改变了RNA聚合酶（抑制剂）的-亚基，其结果使抗生素不能与它结合而失效。利福霉素抑制转录。,2、耐药菌改变对抗生素敏感的部位,（1）由于耐药菌基因突变影响通透系统的某一部分，因而使转运某抗生素的功能部分或全部丧失。（2）产生转运抗生素的拮抗系统。（3）合成一种通透障碍物。,3、耐药菌降低细菌透过抗生素的能力,细菌的耐药基因有的位于染色体上，有的
29、位于染色体外的遗传因子质粒中。它们都是能自我复制的遗传单位，因此耐药性可遗传给后代，另外，质粒通过拷贝可从一个细胞转移到另一个细胞，使耐药性迅速在细菌群体中传播。,4、耐药性的扩散,维生素A缺乏症：夜盲病VB1（硫胺素）：脚气病Vb：佝偻病Vc：坏血病Vk：血凝VB2（核黄素）：口舌炎VE：生育机能受阻VB12（钴胺素）：恶性贫血,人体内缺乏维生素时，会出现维生素缺乏症。,二、维生素生产工艺,（一）、概述,Vitamin可分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类：,脂溶性：VA、VE、Vk水溶性：VC，VB族。,发酵法生产的维生素类药物有：维生素A、维生素B2、生物素、维生素B12、VC等等。,V
30、B2：核黄素（Riboflavin）治疗口角炎,VB12：钴胺素（Cyahocobalamin）治疗恶性贫血,VA：用于治疗夜盲症、眼干燥症等，也用于癌症的防治。VA还可促进骨骼的形成和生长等。,VC：抗坏血酸（Ascorbic acid）,VC参与人体内多种新陈代谢过程，使组织产生胶原质，影响毛细血管的渗透性及血浆的凝固，刺激造血功能，促使血脂下降，增强机体对感染的抵抗力，可用于防治坏血病和抵抗传染性疾病，促进创伤和骨折愈合以及用作辅助药物治疗，是人体内必需的营养成分。另外，维生素C具有较强的还原能力，可作为抗氧化剂，已在医药、食品工业等方面获得广泛应用。,（二）、维生素C生产工艺,发酵,工艺流程：,提取,转化,即先从D-山梨醇发酵，提取出维生素C前体2-酮基-L-古龙酸，再用化学法转化为维生素C。,（三）、维生素B2生产工艺,目前国内外广泛采用微生物发酵法工业生产维生素B2。能够产生维生素B2 的微生物有细菌、真菌和霉菌，工业生产中主要以阿舒假囊酵母(Eremotherecium ashbyii)为生产菌种。维生素B2 的工业发酵一般为二级发酵，发酵液先沉淀再氧化进行分离提纯。,
