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1、五、基因重组与基因工程,（一）重组DNA技术的基础（二）重组DNA技术的基本操作过程（三）重组DNA技术的应用,（一）重组DNA技术的基础,重组DNA技术的定义,在体外，将一种外源DNA和载体DNA重新组合连接，形成杂交DNA，然后将其转入宿主细胞，最终使外源DNA在宿主细胞中随着宿主细胞的繁殖而增殖和表达,从而改变生物原有遗传性状的过程，称为重组DNA技术。它是按生物科学规律，在体外人为的改造基因，最终往往使生物的遗传性状获得改变，故又称为“遗传工程”，亦即“基因工程”。,1.重组DNA技术的基础,(1)重要的工具酶(2)载体,（1）重要的工具酶,它能够识别、切割双链DNA分子中的特定序列，
2、这些特定序列多数为反向重复序列，一般长度是4、5或6bp。,限制性内切酶,粘性末端 如 EcoR I:5-GAATTC CTTAAG-3 平齐末端 如 HaeIII:5-GGCC CCGG-3,DNA连接酶,目前使用的连接酶有两种：大肠杆菌DNA连接酶 黏性末端连接；T4 连接酶 黏性和平齐末端连接。,（2）载体,概 念 能将外源DNA带入宿主细胞，进行复制扩增或最终使外源基因得以表达的自主 DNA，称为载体（vector）。分 类 克隆载体 用于基因的复制、扩增、测序等；表达载体 用于目的基因的表达。,（二）重组DNA技术的基本操作过程,1.目的基因的获得 2.选择和制备载体 3.将目的基因
3、与载体进行切割连接 4.将重组体导入受体细胞 5.阳性克隆的筛选和鉴定 6.DNA重组体的扩增、表达等研究,重组DNA技术的基本操作过程,1.目的基因的获得,（1）提取DNA后，PCR体外特异扩增（2）以mRNA为模板，反转录合成cDNA。（3）化学合成基因（4）限制性内切酶从载体上切取（5）构建基因文库，调取目的基因,2.载体的选择和制备,原核生物常用的载体：质粒和噬菌体；真核生物常用的载体：动物病毒、酵母；穿梭载体：通常是指那些既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖的载体。,目的基因与载体的酶切与连接,3.,4.重组DNA导入宿主细胞,大肠杆菌、酵母、真菌及各种真核细胞、受精卵细胞都可用
4、于重组。,转化,转染,-,5.目的基因的筛选和鉴定,（1）遗传学方法（2）核酸杂交法（3）PCR方法（4）酶切鉴定,（1）遗传学方法,利用载体的特殊标记 如质粒含有抗青霉素的基因，当含外源DNA的质粒转化后可在含有青霉素的培养基中生长，而未转入质粒的细菌在同样的条件下不能生长。,（2）核酸杂交法,菌落原位杂交,2,3,6,2,6,（3）多聚酶链式反应,20世纪80年代末发展起来的一种DNA特定片段体外快速合成扩增的方法，称多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）。PCR技术具有高度的灵敏性和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳
5、，可以直接观察产物的存在。因此，PCR技术对于鉴定阳性克隆十分有效，而且无需制备DNA。,（4）酶切鉴定,目的基因表达,6.,（三）重组DNA技术的应用,1.DNA指纹技术 2.转基因动物与动物克隆 3.基因诊断与基因治疗,1.DNA指纹技术,DNA指纹(DNA fingerprint)技术是20 世纪70年代末发展起来的遗传标记的方法。遗传标记（genetic marker）是指可用来区分不同群体或个体，又能稳定遗传的某些物质。生物个体间的差异在本质上是 DNA的差异，因此DNA是最可靠的遗传标记。,（1）限制性片段长度多态性,真核生物的DNA分子很长，在遗传过程中DNA碱基由于替换、重排、
6、插入、缺失等原因，在子代DNA中会引起差异形成多态性。当用一种限制性内切酶去切DNA时，DNA分子会降解成许多长短不等的片段，个体间这些片段是特异的，可以作为某一DNA（生物）的标记，将这种方法称为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）。,个体 1,个体 2,在人体DNA文库中发现的由970bp重复单位串联重复排列而成的高变异区，称为小卫星DNA（minisatellite DNA）。不同个体的多态性来源于重复单位的重复次数不同，同一家族小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列，用某一小卫星DNA作探针，可与同一或不同物
7、种多酶切DNA片段杂交，获得DNA指纹图谱（DNA fingerprint）。所有真核生物基因组中还存在由2-6bp为重复单位的重复顺序，因其重复单位比小卫星短，称为微卫星DNA（microsatellite DNA）。,真核生物的小卫星DNA,人的DNA 指纹图谱,（2）随机扩增多态性DNA,随机扩增多态性DNA（Randomly Amplified polymorphic DNA，RAPD），又称随机引物PCR。是以910 个核苷酸的随机序列作引物，以基因组DNA为模板进行PCR 扩增。产物电泳后紫外观察，不同个体的图带差异明显，如DNA指纹图谱一样。,个体 1,个体 2,2.转基因动物与
8、动物克隆,（1）转基因动物（2）体细胞克隆无性繁殖,1982 年，人们将大白鼠的生长激素基因放在质粒中小白鼠金属巯基蛋白启动子之后。将重组好的这种质粒，用特制的微量注射器注入小鼠受精卵的雄性原细胞核中，再将这个受精卵植入小鼠子宫中。,（1）转基因动物,启动子,结果为发育成熟的小鼠体重比对照小鼠大两倍，成为“硕鼠”或“超级鼠”。,1986 年，美国制备出转生长激素基因的猪。这种猪生长快，饲料转换率和瘦肉率显著提高而肥膘低，与注射生长激素的效果相同。我国现制备出转基因猪、羊、兔等。然而，转生长激素基因的猪生殖能力明显下降，不能繁殖扩群。,1996 年 7 月世 界第一例从成年 动物体细胞，克 隆出
9、的哺乳动物 绵羊“多利”诞生。1997年2月 Nature杂志报道 将这个秘密向世人 公布。,（2）体细胞克隆无性繁殖,克 隆 羊 多 利 的 产 生 过 程,多利羊之父 威尔穆特教授 英国爱丁堡 罗斯林研究所，苏格兰胚胎学 家。,1998年 克隆批量化,美国克隆出50多只老鼠。日本克隆出8只完全一样的小牛。,美国俄 勒冈州 沃尔小 组成功 克隆两 只恒河 猴。,2000年人类的近亲被克隆,克隆猪 同年，帮助培育出多利羊的生物技术公司克隆出5只小猪仔，并宣称克隆猪终将成为人类移植器官的“加工厂”，生产器官包括角膜、皮肤、肾、肝、肺、心脏等。珍稀濒危动物的繁殖 克隆大熊猫的实验已开始报道。,20
10、01年至今关于克隆人,关于克隆人的问题争论的很激烈，在理论上，利用同样方法，人可以克隆人，但各国至今还不允许克隆人。2001年，美、意科学家联手展开克隆人体胚胎的工作。11月，美国科学家宣布首 次克隆成功了处于早期阶段的人类胚胎，称其目标是为病人“定制”出不会诱发排异 反应的人体细胞用于移植。,2004年8月11日英国颁发全球首张“克隆人类胚胎”执照，合法执照有效期为一年，胚胎14天后必须毁坏，培育克隆婴儿仍属非法行为。研究目的 增加人类对自身胚胎发育的理解；增加人类对高危疾病的认识和高危疾病治疗方法的研究。,克隆动物存在的问题,克隆动物健康问题很多，世界各地的克隆动物流产、夭折、畸形现象非常严重。尽管现在关于克隆的争论很多，但有一点是肯定的，那就是克隆技术远不成熟，应用克隆技术时需格外慎重。多利虽顺利怀孕生子，但寿命短，2003年月 2 月 15 日，仅岁半的多利羊死亡。,3.基因治疗,是指在特定靶细 胞的基因组中，插 入外源基因或用外 源基因置换异常基 因，使细胞表达本 来该基因不表达的 产物，籍以补偿或 抑制异常表达的基 因，达到治疗疾病 目的，称为基因治 疗（genetherapy）。,思考题,1.简述DNA重组技术的基本过程？2.基因工程载体包括哪些种类？3.获得目的基因的方法有哪些？4.试述核酸鉴定与DNA重组技术的实际应用。,
