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1、定向基因改造设想,设想一,能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？,能否让细菌“吐出”蚕丝？,设想二,能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？,设想三,能合成水母荧光蛋白的荧光兔,这是一种科研人员从特殊水母中提取的绿色荧光蛋白基因，将该基因转染到培养的兔子成纤维细胞中，再挑选出发绿色荧光的转基因体细胞，将其细胞核移植到成熟的去核兔子卵母细胞中，最终构成了转基因胚胎。胚胎经过手术，移植入“代孕兔”体内。经过30天的发育，就通过剖腹产获得了这只转基因克隆兔。由于兔子与人的生理比较接近。克隆兔可作为帮助人类筛选药物、研究遗传学疾病的“动物模型”，有助于研究一些人类遗传疾病。,能合成人胰岛素
2、的大肠杆菌,每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取45g。,1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。,治疗糖尿病特效药,据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。,胰岛素,思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？,密码子在生物界是的！,通用,专题1 基因工程,题图：科技探索之路：1.1 DNA重组技术的基本工具1.2 基因工程的基本操作程序1.3 基因工程的应用1.4 蛋白质工程的崛起,什么叫基因工程？,基因工程，又叫DNA重组技术。是指按照人们的
3、愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,基因工程的概念,基因工程的概念,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的新生物类型和产品,剪切,拼接,导入,表达,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,达尔文提出生物进化论,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,早期基础理论,摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律。,基础理论和技术发
4、展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,克里克等提出中心法则,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,后期基础理论,1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之
5、路,1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？,普通棉花抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,在以上过程中关键步骤或难点是什么？,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,通过运载体导入,转基因棉花含抗虫基因,转基因棉花产生伴胞晶体,转基因棉花有抗虫特性,一、DNA重组技术的基本工具,基因工程培育抗虫棉的关键步
6、骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与棉花DNA“缝合”,关键步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,一、DNA重组技术的基本工具,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子手术刀”限制性核酸内切酶,“分子缝合针”DNA连接酶,“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,一、DNA重组技术的基本工具,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,主要来源：种类与命名：作用特点：4.限制酶识别序列5.作用结果：,识别特定核苷酸序列,原核生物,产生黏性末端或平末端,Go on,切断磷酸二酯键,具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DN
7、A分子,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,种类与命名：,现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。,EcoR,Sma,粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）,大肠杆菌（Escherichia coli R）,Go back,练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilus influenzae d)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:,Hind、Hind和Hind,T,磷酸二酯键,A,Go back,限制酶的识别序列：,Go back,Sma,平末端平末端,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back
8、,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back,重复演示,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。,想一想限制酶所识别的序列有什么特点？,寻根问底,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,思考与探究
9、 P7,1、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,思考?,GAAT
10、TCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,EcoR,将不同种来源的DNA片段连接起来,生物A基因片段,生物B基因片段,GAATTCCTTAAG,GAATTCCTTAAG,酶切,二、“分子缝合针”DNA连接酶,作用:,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.,作用原理：,催化磷酸二酯键形成,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,Ecoli DNA连接酶或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,T4DNA连接酶,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4
11、噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,寻根问底,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,Go on,模拟制作：,用剪刀在特定部位对棉花DNA进行模拟切割，并将模拟毒蛋白基因取出，再用胶纸模拟基因种间连接。,棉花的一段DNA,含毒蛋白基因的细菌DNA片段,G
12、o back,三、“分子运输车”基因进入受体细胞的载体,载体需要的条件：,常用运载体：细菌的质粒噬菌体的衍生物或某些动植物病毒,作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,1）载体DNA 必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA 必须具备自我复制能力，或整合到受体染色体DNA 上，随染色体DNA 的复制而同步复制。3）载体DNA必须有标记基因，以便重组后进行筛选。4）载体DNA 必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物
13、细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和体外操作。,常用的载体：质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,最常用：大肠杆菌质粒,2,7,4,8,3,6,1,5,2、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？,提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,思考与探究 P7,1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便
14、目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,3、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗
15、？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,思考与探究 P7,已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。,对照组：不添加抗生素,实验组1：添加一定浓度的四环素,实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素,实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素,练习,既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因,只含有抗四环素基因,只含有抗氨苄青霉素基因,既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因,1下列关于限制性核酸内切酶的叙述中
16、，错误的是（）A 它能在特殊位点切割DNA分子 B 同一种酶切割不同的DNA产生的黏性末端能够很好 地进行碱基配对 C 它能任意切割DNA，从而产生大量DNA片段 D 每一种限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列,2在基因工程中，切割质粒和含有目的基因的DNA片段，需要使用（）A 同种限制性核酸内切酶 B 两种限制性核酸内切酶 C 同种DNA连接酶 D 两种DNA连接酶,3DNA连接酶的作用是（）A 使DNA子链和母链之间形成氢键B 使黏性末端之间形成氢键而相连C 连接DNA分子中脱氧核苷酸和磷酸之间的化学键D 以上都不对,5.不属于质粒被选为基因运载体的理由是（）A.能复制 B.有多个限制
17、酶切点 C.具有标记基因 D.它是环状DNA,本节内容小结：,1.知识梳理：DNA重组技术的基本工具：限制酶（分子手术刀）：识别特定的核苷酸序列并切割两核苷酸之间的磷酸二酯键；DNA连接酶（分子缝合针）：连接两核苷酸之间的磷酸二酯键；基因进入受体细胞的载体（分子运输车）：最常用的是细菌质粒，还有噬菌体的衍生物、动植物病毒等。,2.方法、技巧、规律总结：,限制酶切割的是磷酸二酯键，而DNA连接酶连接的正是两个断开此键的DNA片段。“分子运输车”是目的基因进入受体细胞的载体，它具有的若干特点是基因工程鉴定、选择、表达的关键，可以说，没有它，目的基因即使进入受体细胞，也难以稳定保存，更谈不上复制和表
18、达。3.思维误区提示：DNA连接酶与DNA聚合酶根本不是同类酶，其功能特点大不相同，注意其区别。,DNA连接酶和 DNA聚合酶的异同：,基因工程中所用的连接酶有两种：从大肠杆菌中分离得到的Ecoli连接酶、从T4噬菌体中分离得到的T4连接酶。这两种酶的催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。连接酶和聚合酶的作用都是形成磷酸二酯键。DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成子链；而连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接
19、起来，因此连接酶不需要模板。两者都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。,动动手:,目的要求：模拟重组DNA分子的操作过程,说出其基本原理,材料用具：两种有不同碱基序列颜色的硬纸板,剪刀(代表EcoliI),透明胶带,方法步骤：,重组DNA分子的模拟操作,思考与讨论：,该过程中,如果碱基不能配对,你认为是什么原因造成的?,1、分别从两纸板上找出EcoliI的切割位点进行切割.2、将白色纸板的DNA片段重组到彩色纸板切口处.3、用透明胶带将切口黏结起来.,注意：这两条DNA分子的碱基对不是随意乱写的。首先，每个DNA分子上的两条链上的碱基要互补配对；第二，每个DNA分子中每条链都存在一个G-A-A-T-T-C的碱基序列，也就是说是EcoRI限制酶的识别位点，并存在G-A的切割位点。,CTTCATGAATTCCCTAA,GAAGTACTTAAGGGATT,GAATTCCGTAGAATTCGGATT,CTTAAGGCATCTTAAGCCTAA,模拟体验,甲DNA（环形）,乙DNA片段,EcoRI 剪切甲、乙这两个DNA分子,
