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1、水杨酸-3-羟化酶通过调停水杨酸的分解代谢控制拟南芥叶片寿命植物激素水杨酸（SA）在植物的防御机能、应激反应和衰老中起着重要的作用。尽管SA的生物合成（途径）已经被很好的了解了，但是SA是以哪种方式被异化分解代谢还是难以捉摸的。我们在叶片的衰老期中找到一种涉及到SA的异化分解的物质水杨酸-3-羟化酶，并在这篇文章中报道该酶鉴定方法和特性描述。在植物衰老期间，S3H（水杨酸-3-羟化酶）可以通过SA诱导的与植物衰老产生联系，并且是SA标准的负反馈调节系统中的一个关键部分。这种酶将SA（Km=58.29M）转变为2,3-2羟基苯甲酸和2,5-2羟基苯甲酸在试管内但是仅仅2,3-2羟基苯甲酸是活泼的
2、（估计是有活性的）。S3H淘汰的突变体未能产生2,3-2羟基苯甲酸糖耦合物（偶联物），因此积累了非常高水平的SA（这里估计指含量）以及SA的糖耦合物，然后使植物过早的呈现出衰老的迹象。相反的，S3H（突变产生了功能，估计能分解SA和它耦合物的S3H）列出了一个现象，包含高水平含量的2,3-2羟基苯甲酸耦合物以及极低水平的SA和它的耦合物，展示了一个令人注意的可以延长叶片寿命的能力。这篇文章揭示了一个简洁的SA异化代谢的机理即植物调节SA含量通过将SA转变为2,3-2羟基苯甲酸来阻止SA积累过多。这篇文章也提供了一个强有力的分子基因证据关于SA在调节叶片衰老的起始和评估（rate和onset）中
3、起着重要的作用。SA（水杨酸，又称2-羟基苯甲酸），是一种酚类化合物，已经被人类分析利用其医学价值200多年了，最近其作为一种植物激素在植物抗病、叶片衰老、开花和生热作用（产热机能）也已经被更多的研究开发出来。SA在植物防御功能和超敏反应（一种植物快速编程性细胞死亡的形式）中扮演的角色也已经被集中地调查出来。叶片衰老是一种慢速的编程性细胞死亡，在这种过程中可以允许植物把衰老细胞中的营养品释放并运往种子、贮藏器官或者有活性的正在成长的组织。尽管有关SA在叶片衰老中所扮演的角色还不是很清楚，但是这里还是有一些事实能证明SA的重要作用：在疾病预防和叶片衰老这两者似乎分享了SA的信号传递和管理中某些部
4、件（成分）。已经有更多的研究来指出SA的生物合成。在植物中，有两种SA的生物合成途径：1.PAL（苯基丙氨酸氨基裂解酶）途径和IC（异分支酸合成酶）途径。两种途径都是使用分支酸的初级代谢产物。这个分支酸衍生物L苯基丙氨酸能够被转化为SA通过中间产物苯酸盐或者香豆酸经过一些列的酶促反应涉及到PAL、苯甲酸-2-羟化酶和其他通用酶。分支酸也能够被转化为SA通过异分支酸在2个步骤的处理下，期间涉及到异分支酸合酶（ICS）和异分支酸-丙酮酸裂解酶。在拟南芥中，2分子的ICS酶能将分支酸转化为异分支酸已经被证实；在病原体和紫外光的诱导下90的SA可以有IC途径产生。在植物中，SA可能会经历生物学相关的化
5、学修饰，比如糖基化、甲基化以及氨基酸配合。SA已经被展示可以转化为SA糖耦合物、SA O-葡萄糖苷（SAG）和水杨酰葡萄糖酯通过SA葡糖基转移酶。这些水杨酸的配糖体会主动地从细胞液转移到液泡中作为一种不活跃的储存仓库为以后转化回SA做准备。甲基化的不活跃的SA仅仅增加了SA的膜通透性和挥发性，因此可以允许更有效的长距离运输这种防御信号。氨基酸配合的SA可以被追踪到在被感染的拟南芥中。最近，高水平的2,3-和2,5-2羟基苯甲酸糖耦合物被发现在被感染的或者老化的拟南芥叶片中，它们看起来主要是SA的不活跃形式。SA在转基因拟南芥中表达出了细菌性的水杨酸羟化酶（NahG基因编码）被引导转化为邻苯二酚
6、；这个NagG转基因植物因此被广泛的应用到涉及SA的植物防御和衰老的研究中。然而，这种酶，可以对2，3-和2，5-2羟基苯甲酸的形式作出解释的酶，可推测为SA羟化酶至今还没有被鉴定出来。在这篇文章中，我们报道我们的发现和特性描述关于独一无二的SA3-羟化酶能够将SA转化为2,3-2羟基苯甲酸，SA主要贮藏形式2,3-2羟基苯甲酸糖耦合物的前导物以及在SA的分解代谢，体内平衡以及叶片衰老的调控起着重要的作用。结果SAG108/S3H是一个衰老相关的基因且能够被水杨酸诱导。在4g10500是早先被鉴定的作为植物衰老基因关联的基因叫做SAG108通过我们先前的关于叶片衰老的分析在拟南芥中，被发现其编
7、码有功能的S3H在这里被描述。RNA印迹技术分析显示S3H转录产物累积在正在衰老的叶片中，但是几乎很少被检测到在未衰老的叶片中，显示与广为人知的衰老相关转录因子AtNAP（Fig.1A）表达出相同的模式。S3H调节植物衰老的起始和过程。为了研究S3H的生物功能，一个转移DNA（T-DNA）插入一段序列（SALK-059907）作为特征。这个序列包含一个T-DNA插入S3H的第二个外显子完全禁止S3H的表达在纯合的突变体植物中，这个现象可以在RNA印迹中显示出来。这个S3H基因敲除的植物表现出引人注目的加速叶片衰老的表型通过与那些年龄一致的WT植物相比具有较低的叶绿素含量以及荧光含量与最大荧光含
8、量的比值变小。然而，在初期阶段植物即种子发芽25天后发育表型看起来是正常的。FvFm可以反映出光合系统2中的活性。在S3H突变体中，叶片的衰老被加速主要有两个方面。首先，衰老速度加快。在WT植物中从叶片顶端到叶柄平均要9.5天才会衰老，而S3H突变体的叶片仅仅只用2.7天。第二，叶片衰老的起始变早了（可以从叶端的黄色看出来）；在S3H突变体出现这个现象的时间在16.8天以后，与WT出现的时间19.2天相比。更早的衰老起始和更快的衰老速度可以在叶片的存活曲线中显示出来。这个S3H的无效突变可以解释这个表型，因为有一个构件pGL3228运输完整的S3H（包括它的启动子区域）为WT植物修复S3H。相
9、反的，在WT植物中，由于花椰菜花叶病毒35S的引导（Fig.S2），S3H被过度表达时，叶片的衰老出现了令人注目的推迟（图Figs2D-F和3A），但是它的开花期却没有变化（Fig.3A）。如图Fig.2D，45DAGWT植物中的叶片开始衰老但是与年龄差不多的S3H过表达的植物叶片还是保持着绿色。与9.5天的WT植物和2.7天的S3H相比，在S3H超表达系中需要14.6天叶端从叶柄衰老。在S3HOE中的叶片衰老起始有21.2DAE，与19.2DAE在WT植物中和16.8DAE在S3H中也推迟了。衰老相关的基因和防御相关的基因这两种基因的表达在S3H中被加快而在S3HOE系中被推迟。为了增加对上
10、述表型的特性描述，我们采用RNA印迹法对两种广泛使用的叶片衰老标记基因SAG12和SAG13以及3个SA信号传达的标记基因EDS1，PAD4和PR1，分别在WT，S3H和S3HOE系的处于不同年龄段的叶片（Fig.3B）进行分析。这个高含量的特殊衰老的SAG12的转录产物被很清楚的检测到在35DAGS3H突变体和40DAGWT植物的叶片中检测到。同样的，SAG13，PR1，EDS1和PAD4也被发现出现过早的表达在S3H突变体中但是大大的抑制了过表达系。这些数据表明S3H调控衰老相关的基因和涉及到SA信号表达的基因。S3H调停SA到2,3-2羟基苯甲酸的转化在植物中。采用液相色谱法分析WT，s
11、3h和S3HOE系中年轻和正在衰老植物的代谢产物。游离的水杨酸、水杨酸糖耦合物以及水杨酸衍生物包括2,3-和2,5-2羟基苯甲酸以及他们的糖耦合物的水平含量全部被总结在表格1中。游离水杨酸的含量在年轻的或者正在衰老的S3H突变体叶片中为625以及710在WT植物，然而游离SA的浓度在S3HOE1系列中减少了10-12.5。相似的，SAG的含量也增加到267在s3h突变体中，317在WT植物中。然而，SAG等级减少到无法检测的水平在年轻的和正在衰老的S3HOE1系列的叶片中。与SA形成对比的是，游离的2，3-DHBA和2，5-DHBA的含量以及两种主要的SA代谢物在拟南芥中非常低以至于无法观测到
12、，但是他们的糖耦合物的含量出现了戏剧性转变。在s3h突变体中，游离的SA和SAG被积累到一个很高的水平，正如上文提到的。然而，在新鲜的叶片和正在衰老的叶片中，2,3-DHBA糖耦合物的总含量却无法检测到在s3h突变体中，反之，2,5-DHBA的含量增加到113，在WT中增加到162。恰恰相反的是，在S3HOE1叶片中，2,3-DHBA糖耦合物显著地增加到187，在WT中增加到224，但是，2，5-DHBA糖耦合物却明显的减少到43，在WT中减少到40。这些数据强烈的表明S3H将SA转化为2,3-DHBA在生物体内。重组的S3H中拥有SA3-和5-羟化酶的活性。连续的分析表明S3H编码的蛋白与2
13、-氧化戊二酸-Fe氧合酶家族酶相似（包括著名的F3H酶）都拥有保守的催化区Pfam PF03171（图S3和S4）。上述的植物化学的分析暗示着S3H催化SA分解为2,3-DHBA，我们采用生化分析来证明酶的活性通过使用在大肠杆菌中重组S3H酶的过表达。为了消除由于羟基自由基产生对SA的非酶氧化，我们加入了过氧化氢酶在每一个反应中为了出去羟基自由基。这个重组S3H酶将SA转化为2,3-DHBA和2,5-DHBA在二价铁、抗坏血酸盐、氧化戊二酸以及过氧化氢酶的参与下。这些由重组S3H酶产生的2,3-DHBA和2,5-DHBA有着相同的保留时间和紫外线光谱与在正常情况的产生的2,3-DHBA和2,5
14、-DHBA（Fig.4B-D）。2，3-DHBA和2,5-DHBA的最大紫外光谱也是一个很好的特征（Fig.4E和F）。温度从4到40酶活性逐渐增加，温度从40到50酶活性逐渐降低，说明该酶的最适温度大约在40左右（FigS5A）。酶活性的最适PH是6.0在我们的检测下（Fih.S5B）。在最适温度和最适PH的条件下，重组提S3H产生的SA的Km约等于58.29M（Fig.4G）关于重组提S3H的底物专一性的测验，我们采用两种与SA有着相似结构的苯甲酸和邻氨基苯甲酸，S3H酶在这两种化学物质中存在30分钟并未发生催化作用，可见重组S3H有着高的底物专一性。我们的研究已经展示了一种独一无二负反馈
15、管理机制通过植物调节其内源性的SA等级在植物叶片衰老的起始以及衰老过程中，并且提供强有力的分子基因证据来说明S3H通过调节SA的含量，对叶片衰老起着关键性的作用。SA的生物合成和分解代谢对理解其生物学功能有着很重要的作用。PAL和IC两种途径已经被很好的研究以及也被建议是2种主要的SA的生物合成途径。然而，SA的分解代谢并没有被很好的理解。我们对于S3H的鉴别和特征描述揭露了一种植物调节SA水平的负反馈调节机制。简略的说，SA诱导产生了S3H，诱导产生的S3H酶反过来把SA水解为2,3-DHBA，即一种SA无活性存在形式，可以保护SA的过表达。通过S3H很容易被SA诱导产生以及S3H在衰老叶片
16、中高含量的表达很有可能是由于内源性SA含量增多的这两件事实证实了这个反馈调节机制（表格1和refs.16和24）。在SA缺陷的NahG转基因植物中的衰老叶片中，S3H的表达几乎无法检测出来，但是在茉莉酮酸酯缺陷的突变体coil和乙烯信号传递突变体ein2中S3H的表达不受影响。S3H的酶活性也能进一步证实这个反馈调节。尽管在试管内重组体S3H拥有能够将SA转化为2，3-和2,5-DHBA的3-羟化酶和5+羟化酶活性（Fig.4）。S3H更多的表现为SA3-羟化酶的活性在生物体内因为中断S3H修饰2,3-DHBA糖耦合物没有被检测到，以及过表达的S3H会导致高含量积累的2,3-DHBA（表1）相
17、反的是，2,5-DHBA糖耦合物在s3h中增加在过表达系中减少（表1），造成的原因大概是SA代谢量的不稳定在这些突变体中。举个例子，在Fig.5中，因为SA转化为2,3-DHBA被阻止在s3h中，更多的SA开始参加2,5DHBA的转变。这是被公认的（假设）2,3-和2,5-DHBA是SA在活性氧的氧化下的产物。我们的研究，不管怎样，提供了一个直接的事实，2，3-DHBA是SA的酶促反应产物，丰富我们目前对SA代谢途径的理解，就如Fig.5中展示的。2,5-DHBA是否也是酶促反应的产物有待研究。我们的研究也报道了一个强有力的分子基因证据，在拟南芥中S3H在管理植物衰老起始和过程中有着至关重要的
18、作用通过调节内源性SA的含量。S3H最先被发现是在我们的叶片衰老转录分析中作为衰老相关基因在植物衰老时其转录加强（Fig.1A）。叶片衰老加快在T-DNA插入点s3h被敲除的植物中除了在S3H过表达系中（就是说在S3H过表达系中衰老是减慢的Fig.2和3A）。特别的，在我们的生长条件下，一株WT植物叶片开始衰老（迹象是在叶端开始变黄）在19.2DAE以及需要9.5天从叶端开始到叶柄全部变黄。作为比较，s3h或者S3HOE植物的叶片开始衰老的时间比WT植物早2.4天或者延迟2天。叶片衰老的速率在s3h中比WT快了71，在S3HOE慢了54与WT相比（Fig.2G）。叶片衰老时的标记基因SAG12
19、和SAD13的表达量也提高了在s3h但是被抑制了在S3HOE中。S3H调控叶片衰老更多的是控制SA的含量。正如上面所讨论的，S3H在植物体内调节SA含量通过负反馈调节机制。SA的含量在正在衰老的叶片中比年轻的叶片中要更高一些（表1）。而且，这个SA的含量在s3h中比WT中要高很多（表1）。相反的，SA的含量在S3HOE中更低（表1）。早先一些相关的研究表明低含量的SA在年轻的叶片中以及在衰老中的叶片高度集中已经说明SA促进叶片的衰老。对SAG101（在SA信号传导时与PAD4和EDS1起相互作用）的抑制可以延迟叶片的衰老，从另一个角度说明了SA在叶片衰老中所起的重要作用。细菌基因性的过表达的N
20、ahG减少了SA的含量从而延迟了叶片的衰老也能进一步说明SA在促进植物衰老中的作用。我们的研究提供了2件事实来说明SA在植物衰老中的作用。其中一件事实是来源于S3HOE植物，比如NahG植物，有着非常低的SA含量然后展示出明显的推迟叶片衰老。另一个事实来源于s3h基因敲除植物，积累着很高的SA含量然后显示出了过早的衰老迹象。应该值得注意的在涉及到SA时尽管NahG过表达植物已经被广泛的使用，但是通过数据介绍细菌基因却是相当复杂的。举个例子，NahG酶将SA转化为邻苯二酚，与SA的自然代谢产物相当不同。因此，在将来，我们的S3HOE可能会是一个更好的系统对于SA关联的研究。除叶片衰老之外，S2H
21、似乎在植物防御机能中也扮演着一个重要的角色。分析一些目前已出版的文章和网络资源，S3H能够被病原体感染所诱导。保持一致性的是（这里指与前文的一些现象保持一致）2,3-DHBA衍生物的含量会增加在拟南芥感染了病原菌以后。基因敲除和超表达基因分别导致提高对假单胞杆菌和减弱对假单胞杆菌的抵抗力。在未来的研究中需要证明这个现象。材料与方法（一些实验步骤和方法，并没有全部翻译）植物材料和生长条件生态型拟南芥被广泛的使用作为WT在所有的实验中。这个T-DNA插入序列SALK-059907从拟南芥属的一种植物ABRC中获得。种子保养方法：在包含有Murashiga和Skoog 0.7（质量/体积）的培养皿中
22、，被保存在4的温度下2天在转移到生长室内。将培养到有2片真叶的幼苗转移到康奈尔混合土壤中（3份泥炭土，2份蛭石，1份珍珠岩）。WT、突变体和转基因植物被并排培养在盘子中以最小可能的减少生长条件的误差。植物全都培养在22，湿度为60的人工培养室，光照强度为120mol.m-2s-1，日光灯和白炽灯混合照射。T-DNA插入序列s3h植物的鉴定。特异性引物G2563，G2564以及T-DNA左边界的引物G2325（LB1）被使用来鉴别s3h纯合突变体。化学材料：除特殊说明的材料以外，其余材料都是在阿德里奇化学公司购买。SA处理方法：Col-0植物都喷洒5mM SA在0.0005喜微L-77或者只有0
23、.0005喜微L-77溶液。全部提取单株植物莲座叶片的RNA在不同的时间喷洒以后。技术路线。S3H的编码区，已经通过PCR在特异性引物G2563和G2564的扩增下，被克隆出来由HindIII和PstI细菌携带。克隆出了双元载体pGL800的构成形式pGL3135，可以允许S3H在植物中的表达。DNA片段被从EcoRI中消化释放出BACF7L13（从ABRC中获得）包含整个S3H基因及其启动子和被克隆进入双元载体pPZP211在EcoRI里面形成pGL3228为了s3h的互补。为了获得S3H标记的重组蛋白，S3H的开放区基因区域通过PCR大量扩增，产物为S3H-BamHI和S3H-HindII
24、I，以及被克隆进pET28形成Pet28a-S3H。全部的构建产物都已经通过DNA测序。叶绿素部分，Fv/Fm试验和存活曲线。叶绿素已经被提前提取和定量测定。叶片中的荧光性被测量通过使用一种简易的荧光测定器。每一片叶片都被直接的定量测定Fv/Fm通过荧光计。这个存活曲线是基于观察叶片的黄色程度。完全变黄的植物被认定为死亡叶片。WT、s3h和S3HOE1植物的存活率被认为从20DAG到70DAG。转录产物分析。采用RNA提取法和RNA印迹依次被使用。DNA模板为探针标签已经被以下的引物扩增出来了：S3H,G2956和G32957，AtNAP，G3149和G3150，SAG12,G10和G246，SAG13，G9和G16，EDS1，EDS1F和EDS1R，PAD4，PAD4F和PAD4R以及PR1，PR1F和PR1R。RNA凝胶用溴化已锭着色分析。转化。代谢物分析。S3H重组蛋白的表达和在细菌中的提纯。酶的测定。参考文献。
