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1、发 布中华人民共和国司法部司法鉴定管理局司法鉴定技术规范2016-9-22实施2016-9-22发布生物检材中苯丙胺类兴奋剂、哌替啶和氯胺酮的测定SF/Z JD01070042016目 次前言I1 范围12 规范性引用文件13 免疫筛选法原理14 免疫筛选法试剂15 免疫筛选法操作方法16 免疫筛选法结果判定17 气相色谱-质谱联用法原理28 气相色谱-质谱联用法试剂和材料29 气相色谱-质谱联用法仪器210 气相色谱-质谱联用法测定步骤311 气相色谱-质谱联用法结果计算512 气相色谱-质谱联用法方法检出限513 液相色谱-串联质谱法原理514 液相色谱-串联质谱法试剂和材料515 液相色
2、谱-串联质谱法仪器616 液相色谱-串联质谱法测定步骤617 液相色谱-串联质谱法结果计算818 液相色谱-串联质谱法方法检出限8附录A（资料性附录）血液、尿液和毛发中AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮的检出限9前 言本技术规范按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本技术规范的附录A为资料性附录。本技术规范由司法部司法鉴定科学技术研究所提出。本技术规范由司法部司法鉴定管理局归口。本技术规范起草单位：司法部司法鉴定科学技术研究所。本技术规范主要起草人：刘伟、卓先义、向平、沈保华、卜俊、马栋、严慧。本技术规范所代替规范的历次版本发布情况为：SF/Z JD0107004-20
3、10。生物检材中苯丙胺类兴奋剂、哌替啶和氯胺酮的测定1 范围本技术规范规定了血液、尿液及毛发中苯丙胺（AMP）、甲基苯丙胺（MAMP）、3、4-亚甲双氧甲基苯丙胺（MDMA）、4、5-亚甲双氧苯丙胺（MDA）、哌替啶和氯胺酮的测定方法。本技术规范适用于血液、尿液及毛发中AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶和氯胺酮的定性定量分析。2 规范性引用文件下列文件对于本技术规范的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本技术规范。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本技术规范。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GA/T 122 毒物分析名词
4、术语第一篇 免疫筛选法3 原理采用高度特异性的抗原-抗体反应的免疫胶体金层析技术，通过单克隆抗体竞争结合苯丙胺或甲基苯丙胺偶联物和尿液中可能含有的苯丙胺或甲基苯丙胺，试剂盒含有被事先固定于膜上测试区（T）的苯丙胺或甲基苯丙胺偶联物和被胶体金标记的抗苯丙胺或甲基苯丙胺单克隆抗体。4 试剂苯丙胺尿液胶体金法试剂盒，甲基苯丙胺尿液胶体金法试剂盒。5 操作方法用吸管吸取尿液检材，滴入试剂盒的样品孔中5滴（约150200mL），35分钟后观察结果。6 结果判定6.1 苯丙胺尿液胶体金法试剂盒6.1.1 阳性仅质控区C出现紫红色带，而测试区T无紫红色带，提示含有苯丙胺成分。6.1.2 阴性质控区C及测试区
5、T均出现紫红色带，表明尿液中无苯丙胺或苯丙胺浓度在1000ng/mL以下。6.1.3 无效质控区C未出现紫红色带，结果无效，应重新检验。6.2 甲基苯丙胺尿液胶体金法试剂盒6.2.1 阳性仅质控区C出现紫红色带，而测试区T无紫红色带，表明甲基苯丙胺浓度在1000ng/mL以上。6.2.2 阴性质控区C及测试区T均出现紫红色带，表明尿液中无甲基苯丙胺或甲基苯丙胺浓度在1000ng/mL以下。6.2.3 无效质控区C未出现紫红色带，结果无效，应重新检验。第二篇 气相色谱-质谱联用法7 原理利用苯丙胺类兴奋剂、哌替啶和氯胺酮易溶于有机溶剂、难溶于水的特点，在碱性条件下用有机溶剂从生物检材中提出，用气
6、相色谱-质谱联用仪进行检测，经与平行操作的苯丙胺类兴奋剂或哌替啶、氯胺酮对照品比较，以保留时间和特征碎片离子定性分析；以定量离子峰面积为依据，外标法定量。8 试剂和材料除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。8.1 AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶和氯胺酮纯度98%。8.2 AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶、氯胺酮对照品溶液的制备分别精密称取对照品AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶、氯胺酮各适量，用甲醇配成1mg/mL的对照品储备溶液，置于冰箱中冷冻保存，有效期为12个月。试验中所用其它浓度的标准溶液均从上述储备液稀释而得，冰箱中冷藏保存，
7、有效期为6个月。8.3 10%氢氧化钠溶液8.4 乙醚8.5 甲醇8.6 丙酮8.7 0.1%十二烷基磺酸钠溶液8.8 0.1%洗洁精溶液8.9 0.1mol/L盐酸溶液9 仪器9.1 气相色谱-质谱联用仪配有电子轰击源（EI）。9.2 分析天平感量0.1mg。9.3 微波炉9.4 涡旋混合器9.5 离心机9.6 恒温水浴锅9.7 空气泵9.8 移液器9.9 具塞离心试管9.10 冷冻研磨机10 测定步骤10.1 样品预处理10.1.1 尿液直接提取取尿液2mL置于10mL具塞离心管中，用10% 氢氧化钠溶液调至pH11，用乙醚3mL提取，涡旋混合、离心，转移有机层至另一离心管中，约60C水浴
8、中挥干，残留物用50mL甲醇溶解，取1mL进气相色谱/质谱联用仪分析。10.1.2 血液直接提取取血液2mL置于10mL具塞离心管中，加入10% 氢氧化钠溶液0.2mL，用乙醚3mL提取，以下同10.1.1项下操作。10.1.3 毛发提取10.1.3.1 毛发采集 贴发根处剪取毛发，发根处作标记。量取长度。10.1.3.2 毛发洗涤 毛发样品依次用0.1%十二烷基磺酸钠溶液、0.1%洗洁精溶液、水和丙酮振荡洗涤，晾干后剪成约1mm段，供检。10.1.3.3 毛发的水解10.1.3.3.1 毛发的酸水解称取50mg毛发，加1mL 0.1mol/L 盐酸溶液浸润，45C水浴水解1215小时，取出后
9、用10% 氢氧化钠溶液调至pH11。10.1.3.3.2 毛发的碱水解称取50mg毛发，加1mL 10% 氢氧化钠溶液，80C水浴水解510min，取出。10.1.3.4 毛发的提取毛发水解液用乙醚3mL提取，涡旋混合、离心分层，转移乙醚层至另一离心管中，约60C水浴中挥干。残留物用50mL甲醇溶解，取1mL进气相色谱-质谱联用仪分析。10.2 样品测定10.2.1 气相色谱-质谱参考条件a） 色谱柱：HP-5MS毛细管柱（30m0.25mm0.25mm）或相当者；b） 柱温：100C保持1.5min，以25Cmin程序升温至280C，保持15min；c） 载气：氦气，纯度99.999%，流速
10、：1.0mL/min； d） 进样口温度：250C； e） 进样量：1mL； f） 电子轰击源：70eV；g） 四极杆温度：150C；h） 离子源温度：230C；i） 接口温度：280C；j） 检测方式：全扫描；k） 质量范围50-500amu。l） AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮的保留时间与特征碎片离子见表1。表1 AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮的色谱峰保留时间与特征碎片离子名称GC/MS保留时间（min）碎片离子（m/z）AMP4.344、911)、120MAMP4.758、911)、134MDA6.677、1361)、179MDMA7.058、13
11、51)、194哌替啶8.071、172、2471)氯胺酮8.41801)、209、152注：1）为定量离子。10.2.2 定性分析进行样品测定时，如果检出的色谱峰保留时间与空白检材添加相应对照品的色谱峰保留时间比较，相对误差在2%内，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，且所选择的离子相对丰度比与添加对照品的离子相对丰度比之相对误差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在这种化合物。表2 相对离子丰度比的最大允许相对误差(%)相对离子丰度比502050102010允许的相对误差2025305010.2.3 定量测定采用外标-校准曲线法或单点法定量。用相同基质空白添加适量目标物对照
12、品制得一系列浓度校准样品，以目标物的峰面积对目标物浓度绘制校准曲线，并且保证待测样品中目标物的浓度在其线性范围内。当待测样品中目标物浓度在添加样品浓度的50%以内时，可采用单点校准。10.3 平行试验待测样品应按以上步骤同时平行测定两份。平行试验中两份检材测定结果按两份检材的平均值计算，双样相对相差不得超过20（腐败检材不超过30%）。双样相对相差按式（1）计算： | C1 - C2|双样相对相差（%） = 100 （1） C 式中：C1、C2 两份样品平行定量测定的结果；C 两份样品平行定量测定结果的平均值（C1+ C2）/ 2。10.4 空白试验除以相同基质空白替代检材外，均按上述步骤进行
13、。11 结果计算以外标-校准曲线法或按式（2）计算被测样品中AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮浓度： A1WC = （2） A2W1式中：C待测样品中目标物的浓度（mg/mL或mg/g）；A1待测样品中目标物的峰面积；A2添加样品中目标物的峰面积；W添加样品中目标物的添加量（mg）；W1待测样品取样量（mL或g）。12 方法检出限血液、尿液和毛发中苯丙胺类兴奋剂、哌替啶和氯胺酮的检出限见附录A。第三篇 液相色谱-串联质谱法13 原理利用苯丙胺类兴奋剂、哌替啶和氯胺酮易溶于有机溶剂、难溶于水的特点，在碱性条件下用有机溶剂从生物检材中提出，提取后的样品用液相色谱-串联质谱法（LC-
14、MS/MS）的多反应监测（MRM）模式进行检测，经与平行操作的苯丙胺类兴奋剂或哌替啶、氯胺酮对照品比较，以保留时间和两对母离子/子离子对进行定性分析；以定量离子对峰面积为依据，外标法定量。14 试剂和材料除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。14.1 AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮对照品及溶液的制备同8.1及8.2。14.2 丙酮14.3 乙醚14.4 10%氢氧化钠溶液14.5 0.1mol/L盐酸溶液14.6 0.1%十二烷基磺酸钠溶液14.7 0.1%洗洁精溶液14.8 乙腈色谱纯。14.9 甲酸优级纯。14.10 乙酸铵色谱纯。14.11
15、流动相缓冲液20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸缓冲液：分别称取1.54g乙酸铵和1.84g甲酸置于1000mL容量瓶中，加水定容至刻度，pH值约为4。15 仪器15.1 液相色谱-串联质谱仪配有电喷雾离子源（ESI）。15.2 分析天平感量0.1mg。15.3 涡旋混合器15.4 离心机15.5 恒温水浴锅15.6 移液器15.7 具塞离心试管15.8 冷冻研磨机16 测定步骤16.1 样品预处理16.1.1 尿液提取取尿液2mL置于10mL具塞离心管中，用10% 氢氧化钠溶液调至pH11，用乙醚3mL提取，涡旋混合、离心，转移有机层至另一离心管中，约60C水浴中挥干，残留物中加入100mL
16、乙腈: 流动相缓冲液（70: 30）进行溶解，取5mL进LC-MS/MS分析。16.1.2 血液提取取血液2mL置于10mL具塞离心管中，加入10%氢氧化钠溶液0.2mL，用乙醚3mL提取，以下同16.1.1项下操作。16.1.3 毛发提取称取50mg毛发，同10.1.3.3项酸水解或碱水解后，用乙醚3mL提取，以下同16.1.1项下操作。16.2 样品测定16.2.1 液相色谱-串联质谱参考条件a） 色谱柱：Allure PFP Propyl 100mm2.1mm5mm或相当者，前接保护柱；b） 柱温：室温；c） 流动相：V（乙腈）：V（缓冲液）=（70：30）； d） 流速：200mL/m
17、in； e） 进样量：5mL； f） 扫描方式：正离子扫描（ESI+）； g） 检测方式：多反应监测（MRM）；h） 离子喷雾电压：5500V；i） 离子源温度：500C；j） 每个化合物分别选择2对母离子/子离子对作为定性离子对。其定性离子对、定量离子对、去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）和保留时间（tR）见表3。表3 AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮的定性离子对、定量离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)和保留时间（tR）名称定性离子对DP(V)CE(eV)保留时间(min)AMP136.1/119.11)20335.12136.1/91.126MAMP150.1/1
18、19.11)30166.07150.1/91.126MDMA194.2/163.41)35185.93194.2/105.029MDA180.1/163.11)40155.01180.1/135.128哌替啶248.3/220.350308.49248.3/174.130氯胺酮238.1/179.11)40255.3238.1/125.140注：1）为定量离子对。16.2.2 定性测定进行样品测定时，如果检出的色谱峰保留时间与空白检材添加对照品的色谱峰保留时间比较，相对误差小于2%，并且在扣除背景后的样品质谱图中，均出现所选择的离子对，而且所选择的离子对相对丰度比与添加对照品的离子对相对丰度比
19、之相对误差不超过表4规定的范围，则可判断样品中存在这种化合物。表4 相对离子对丰度比的最大允许相对误差(%)相对离子对丰度比502050102010允许的相对误差2025305016.2.3 定量测定采用外标-校准曲线法或单点法定量。用相同基质空白添加适量目标物对照品制得一系列校准样品，以目标物的峰面积对目标物浓度绘制校准曲线，并且保证所测样品中目标物的响应值在其线性范围内。当待测样品中目标物浓度在添加样品浓度的50%以内时，可采用单点校准。16.3 平行试验待测样品应按以上步骤同时平行测定两份。平行试验中两份检材测定结果按两份检材的平均值计算，双样相对相差不得超过20（腐败检材不超过30%）
20、。双样相对相差按式（1）计算： | C1 - C2|双样相对相差（%） = 100 （1） C 式中：C1、C2 两份样品平行定量测定的结果；C 两份样品平行定量测定结果的平均值（C1+ C2）/ 2。16.4 空白试验除以相同基质空白替代检材外，均按上述步骤进行。17 结果计算以外标-校准曲线法或按式（2）计算被测样品中AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮浓度： A1WC = （2） A2W1式中：C待测样品中目标物的浓度（mg/mL或mg/g）；A1待测样品中目标物的峰面积；A2添加样品中目标物的峰面积；W添加样品中目标物的添加量（mg）；W1待测样品取样量（mL或g）。18
21、 方法检出限血液、尿液和毛发中苯丙胺类兴奋剂、哌替啶和氯胺酮的检出限见附录A。附录A （资料性附录）血液、尿液和毛发中AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮的检出限血液、尿液和毛发中AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮的检出限见表A。表A 生物检材中AMP、MAMP、MDMA、MDA、哌替啶及氯胺酮的检出限样品成分GC/MS检出限(mg/mL或mg/g)LC-MS/MS检出限(mg/mL或mg/g)尿液AMP0.10.05MAMP0.10.02MDMA0.10.02MDA0.10.05哌替啶0.10.02氯胺酮0.10.02血液AMP0.20.05MAMP0.20.02MDMA0.20.02MDA0.20.05哌替啶0.20.02氯胺酮0.20.02毛发AMP50.2MAMP20.5MDMA20.5MDA50.2哌替啶20.2氯胺酮20.2
