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1、茶氨酸生物合成基因工程菌发酵培养基的优化陆文渊,成浩 *, 王丽鸳,周健(农业部茶叶化学工程重点实验室, 中国农业科学院茶叶研究所, 杭州 310008)摘要:对具有茶氨酸生物合成能力的 - 谷氨酰转肽酶(- GGT)基因工程菌的发酵培养基进行了优化。首先采用 Plackett- Burman 实验设计对影响 - GGT 活性的培养基成分进行筛选,然后将筛选得到的葡萄糖、酵母提取物、K2HPO4 3 个关键影响因素进行响应面分析,通过对二次多项回归方程求解得到关键影响因素的最佳浓度为葡萄糖 10.39 g/L、酵母提取物 6.88 g/L、K2HPO4 7.10 g/L, - GGT 活性的最
2、大预测值为 4.42 U/mL, 实验验证值为 4.40 U/mL。最后通过基因工程菌催化合成茶氨酸反应,酸的产量为 32.22 g/L。关键词: 茶氨酸; - 谷氨酰转肽酶(- GGT); Plackett- Burman 设计; 响应面法(RSM)得到茶氨中图分类号: TS 201文献标志码: A文章编号: 1005- 9989(2008)07- 0018- 04Optimiza tion of cultiva tion me dium for the ge ne tica lly e ngine e re dEs che richia coli s tra in of - Gluta m
3、yltra ns pe ptida s e for the bios ynthe s is of the a nineLU Wen- yuan, CHENG Hao*, WANG Li- yuan, ZHOU J ian( Ke y La b of Te a Che mica l Engine e ring, Minis try of Agriculture , Te a Re s e a rch Ins titute ,Chine s e Aca de my of Agricultura l S cie nce s , Ha ngzhou 310008)Abstr act: This a r
4、ticle s tudie d the optimiza tion of cultiva tion me dium for the ge ne tica lly e ngine e re d Es che richia coli s tra in of - Gluta myltra ns pe ptida s e for the bios ynthe s is of the a nine . P la cke tt - Burma n de s ign wa sunde rta ke n to e va lua te the e ffe cts of s ix cultiva tion me
5、dium fa ctors , glucos e , ye a s t e xtra ct a nd K2HP O4 we re found to be the critica l for the fa ctors a ctivity of - GGT. The n re s pons e s urfa ce me thodology wa s us e d to optimize the a bove critica l fa ctors , the optimum le ve ls of the fa ctors we re glucos e 10.39 g/L, ye a s t e x
6、tra ct 6.88 g/L, K2HP O4 7.10 g/L, with a pre dicte d - GGT a ctivity of 4.42 U/mL, a nd the e xpe rime nta l - GGT a ctivity obta ine d wa s 4.40 U/mL. The yie ld of the a nine from L- Gln a nd e thyla mine wa s 32.22 g/L.Key wor ds: the a nine ; - Gluta myltra ns pe ptida s e ; P la cke tt- Burma
7、n de s ign; re s pons e s urfa ce me thodology茶氨酸(Theanine)是茶叶中一种具有鲜爽味的特征物质, 对于茶氨酸的研究已经成为了当前茶叶科 学的热点之一。已有大量研究报道了茶氨酸对人体成、茶细胞培养等方法虽然能生成茶氨酸,但均存在一定的局限性。随着基因工程和发酵工程技术的发展, 通过构建具有茶氨酸合成能力的基因工程菌来 发酵生产茶氨酸是其生物合成的一条有效途径3。细菌中的 - 谷氨酰转肽酶可以将谷氨酰胺上 - 谷氨酰基转移到乙胺受体上, 催化合成茶氨酸4, 因 此, - GGT 活性的高低将决定茶氨酸生物合成的产的多种保健功能1- 2, 这些
8、研究结果表明,茶氨酸具有很高的医用价值和商业价值。但由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸, 成本非常昂贵, 因此有关它的 合成制备研究越来越受到重视。之前采用的化学合收稿日期:作者简介:2007- 11- 13* 通讯作者陆文渊(1982),男, 浙江海宁人, 硕士研究生, 研究方向为茶叶生物工程。bp)Xho I(158bp)Pstbp)bp)bp)trxA (2029- 2355bp) OripromoterlacI(2834- 3913bp)图 1 基因工程菌质粒图谱量。本实验室已成功将 E.coli DH5的 - GGT 基因50 mL 发酵培养基的 250 mL 三角瓶中,37 、180r
9、/min 振荡培养 4 h(OD600 约 0.8), 然后加入 0.05 mmol/ L IPTG, 32 诱导 4 h, 测定 - 谷氨酰转肽酶活性。与载体 pET- 32a 相连接形成重组质粒 pET- GGT,并将其转化至 E.coli BL21 中,构建了具有茶氨酸生物合成能力的基因工程菌5。为了进一步了解该基因工程菌发酵培养基中关键营养成分对 - GGT 活性的影测定与分析方法细胞生长光密度(OD 值)的测定:1.5发酵液经稀释后响效果, 提高茶氨酸的产量,为今后进一步地研究以 空 白 培 养 基 为 对 照 , 于 波 长 600 nm 进 行 比 色 测定, OD600=OD6
10、00 读数稀释倍数。应用提供依据, 本研究根据大肠杆菌生长所需营养要素的基本原则以及其发酵的一般规律, 结合相关 文献报道与前期实验6- 8, 采用 Plackett- Burman 设计 法及响应面法, 对影响该基因工程菌 - GGT 活性的 培养基成分进行考察和评价, 对筛选得到的关键影 响因素及其交互作用做进一步的研究和探讨, 以确 定适合该基因工程菌生长和最佳 - GGT 活性产生的 最优发酵培养基。- GGT 的测定(Glupa 底物法):将发酵液离心收集 菌 体 , 加 入 1 mL - GGT 测 定 试 剂 于 37 反 应15min, 反应结束后离心, 取上清液 在 405
11、nm 波长 下测吸光度变化, 依公式计算 - GGT 活性大小。酶 活定义为在 37 条件下, 每分钟产生 1 mol 对硝基 苯胺所需的 - GGT 量定义为一个酶活单位。基因工程菌催化合成茶氨酸的方法:将反应体系(L- 谷氨酰胺 0.35 mol/L, 盐酸乙胺 2.0 mol/L,菌1材料与方法体 70 mg/mL, pH9.5)在 180 r/min、32 条件下反应4 h 后 沸 水 浴 5 min, 然 后 室 温 12000 r/min 离 心 5 min, 收集上清液, HPLC 测定茶氨酸含量9。培养基优化方法: 采用 Plackett- Burman 设计法 及响应面法,
12、并用 SAS 软件进行统计分析, Design- Expert 软件辅助作图。供试菌株含 有 细 菌 - GGT 基 因 的 大 肠 杆 菌 工 程 菌pET32a- GGT 由本实验室构建并保存。1.1结果与讨论22.1 Plackett- Burman 设计筛选重要因素Plac kett - Burman 实 验 设 计 是 一 种 两 水 平 实 验设 计 方 法 , 它 可 以 利 用 最 少 的 实 验 次 数 ,从 众 多的考察因素 中 快 速 有 效 地 筛 选 出 主 要 的 影 响 因 素 ,因此 广泛地用于因素主效应的估计10- 11。根据重 组1.2仪器与试剂INFORS
13、 AGCH- 4103 控温摇床, Waters 高效 液大 肠 杆 菌 发 酵 的 一 般 规 律 及 前 期 实 验 ,本 阶 段 选用实验次数为 8 的实验设计, 对葡萄糖(X1)、酵母相 色 谱 仪 , BECKMAN Avanti J- 30I 离 心 机 , TOMYSS- 325 灭菌锅, SHIMADZU UV- 2550 紫 外- 可见分 光光度计, Thermo Forma 超净台;提 取 物 (X2)、 蛋 白 胨 (X3)、 NaCl (X4)、 K HPO (X5 ),2 4MgSO7H O(X6)6 个因素进行考察,每个因素分 别4 2取 两 个 水 平,高 水 平
14、 取 低 水 平 的 1 . 5 倍 ,评 价 指琼脂糖、蛋白胨、酵母提 取 物 :OXOID 公 司 ;标 (响 应 值 ) 为 - GGT 活 性 ,见表 1 和表 2 。实 验 设 计 及 实 验 结 果茶氨酸标样: 日本太阳化学; - 谷氨酰转肽酶测定试剂: 北京华宇亿康生物工程公司;国产分析纯。其他分析试剂:表 1 Plackett- Burman 实验设计因素水平及编码代码编码水平培养基种 子 培 养 基 :mL。1.3相关因素编码未编码- 11LB 液 体 培 养 基 ,含 Amp 50 g/葡萄糖/(g/L)酵母提取物/(g/L) 蛋白胨/(g/L) NaCl/(g/L) K2
15、HPO4/(g/L) MgSO47H2O/(g/L)x1x2 x3 x4 x5 x6X1X2X3X4X5X6105101041157.5151561.5发酵优化培养基: 葡萄糖, 酵母提取物, 蛋白胨 ,NaCl, K2HPO4, MgSO47H2O,含 Amp 50 g/mL1.4。培养方法取活化后的斜面试管菌种接入盛有 50 mL 种子注: 表中自变量编码方程为: xi= Xi- X0/Xi,其中 x1 为自变量编码值,培养基的 250 mL 三角瓶中, 在摇床中 37 、180 r/min 振荡培养 12 h。吸取 0.5 mL 种子发酵液至盛有Xi 为自变量实验水平实际值, X0 为实
16、验水平中心点实际值, Xi 为单变量增量。表 2N=8 的 Plaekett- Burman 实验设计与响应值表表 4 Box- Behnken 响应面设计实验因素水平和编码实验 处理酶活/(U/mL)编码水平X1X2X3X4X5X6关键影响因素- 10112345678- 11- 11- 11- 11- 1- 111- 1- 111- 1- 1- 1- 111111- 1- 111- 1- 111- 11- 1- 11- 1111- 1- 1- 1- 1113.643.444.304.023.283.883.764.34葡萄糖/(g/L) A酵母提取物/(g/L) B K2HPO4/(g/L
17、) C7.52.53105612.57.59表 5 Box- Behnken 响应面实验设计及实验结果 实验处理酶活性/(U/mL)ABC123456789101112131415- 1- 1- 1- 100001111000- 1001- 1- 111- 10010000- 110- 11- 110- 1100003.603.713.853.974.034.294.214.334.093.924.154.194.374.304.39在本研究采用的实验方法和实验条件下,采用SAS 软件对各因素主效应进行分析。从分析结果(表3)可看出, 影响 - GGT 活性的培养基成分的重要性 排序为: 酵母
18、提取物K2HPO4葡萄糖MgSO47H2O 蛋白胨NaCl。其中酵母提取物、K2HPO4、葡萄糖浓度对 - GGT 活性的影响达到了显著水平。因此,选取葡萄糖、酵母提取物、K2HPO4 这 3 个因素做进一步响应面分析, 以确定这 3 个关键因素所对应的最 优水平。MgSO47H2O、蛋白胨、NaCl 3 个因素的确定根据效应的正负和节约成本的原则,度控制在较好水平上进行实验。将其质量浓表 3各因素主效应分析结果大于 F的概率自由度平方和均方F 值SAS 软件对实验数据进行方差分析及二次多项回归拟合(表 6), 得到 - GGT 活性对葡萄糖、酵母提取物、K2HPO4 质量浓度的多元回归模型:
19、Y =4.353333 +0.152500A +0.086250B +0.093750C -0.349167A2 - 0.041667B2 - 0.096667C2 - 0.067500AB +0.022500AC- 0.035000BC式中: Y 为 - GGT 活性的预测值;ABC 分别为上述 3 个自变量的编码值。模型残差611.014700.000450.16912 375.815 0.03950.00045大于 T的概率相关因素自由度参数估计T 检验重要性截距葡萄糖/(g/L)酵母提取物/(g/L)蛋白胨/(g/L) NaCl/(g/L) K2HPO4/(g/L) MgSO47H2O
20、/(g/L)113.8325000.087500511.00011.6670.00120.0544310.27250036.3330.01751上述方程的回归系数显著性检验表明:因素 A、111- 0.017500- 0.0125000.207500- 2.333- 1.66727.6670.25780.34400.0230562B 和 C 对 - GGT 活性的线性效应显著; AB 对 - GGT活性的交互效应影响显著, 其曲面效应也显 著,而AC、BC 对其交互效应影响不显著。从表 6 中可知,用上述回归方程描述葡萄糖、酵母提取物、K2HPO4 与 - GGT 活性之间的关系时, 其线性关
21、系是显著的, 决定系数为 0.9791, 回归方程拟合度很好。由表 7 可知, 该回归模型存在稳定 点 , - GGT 活性的最大估计值 4.415021 U/mL, 3 个主因素取值 分别为葡萄糖 10.393418 g/L、酵母提取物 6.883665 g/ L、K2HPO4 7.100475 g/L。采用培养基 优 化 值 在 相 同 培养条件下进行 6 次重复实验验证, 得到 - GGT 活1- 0.037500- 5.0000.125742.2 - 谷氨酰转肽酶活性响应面法分析与优化响 应 面 法 (Response Surface Methodology, RSM)可以通过建立连续
22、变量曲面模型, 对影响实验过程中的因素水平及其交互作用进行优化与评价,该法已广泛应用于各种过程的优化分析中12。本阶段实验研究采用 Box- Behnken 响应面设计法,对发酵过程中影响 - GGT 活性的关键因素葡萄糖、酵母提取物、K2HPO4 的质量浓度做进一步研究和探讨,以获得其性的平均实 测值为 4.40 U/mL,与预测 值 非 常 接 近 ,最佳浓度水平范围。Box- Behnken 实验设计及实验结果见表 4 和表 5。在本研究采用的实验方法和实验条件下, 运用说明本实验所采用的方法对该基因工程菌进行培养基优化是可靠的。通过 Design expert 软件作了葡萄糖和酵母提取
23、物) L m/U (/性活 T G G-酵母提取物 /(g/L)葡萄糖 /(g/L)图 2 K2HPO4=7.10 g/L 时葡萄糖和酵母提取物交互影响- GGT 活性的曲面图及其等高线图表 6- GGT 活性二次多项式模型方差分析及回归方程系数显著性检验交互影响 - GGT 活性的曲面图及其等高线图(图 2),发现当 K2HPO4 为最佳(7.10 g/L)时,由其椭圆形等高回归项自由度平方和F 检验大于 F 的概率图可以直观地看出, 葡萄糖和酵母提取物这两因素显著的交互作用, 并且在实验水平范围内, 当葡萄糖浓 度较低时, 获得较高活性 - GGT 的酵母提取物为 7一次项平方项 交互项
24、总回归33390.3158750.4686170.0251500.80964230.44645.1682.42426.0130.00120.00050.18140.0011g/L, 当酵母提取物浓度低于 7 g/L 时,适当增加酵母提取物的量可以减少葡萄糖的用量,从而可以减少该相关因素自由度参数估计T 检验大于 T 的概率基因工程菌代谢过程中抑制物质乙酸的积累, 防止发截距A B C A2BA B2CA CBC211111111114.3533330.1525000.0862500.093750- 0.349167- 0.067500- 0.0416670.022500- 0.035000-
25、0.096667128.27.3354.1484.509- 11.409- 2.296- 1.3610.765- 1.190- 3.1590.00000.00070.00890.00630.00010.07020.23150.47870.28730.0251酵液 pH 值过低,从而影响该基因工程菌生长。最佳培养基浓度下发酵所得基因工程菌催化合成2.3茶氨酸在最佳培养基浓度(葡萄糖 10.39 g/L、酵母提取物6.88 g/L、K2HPO4 7.10 g/L、 蛋 白 胨 10 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO47H2O 1 g/L)下发酵培养所得的茶氨酸生 物合成基因工程菌催化 L-
26、 谷氨酰胺和盐酸乙胺反应谷氨酰胺的转化率生成的茶氨酸产量为 32.22 g/L,为 52.8%, 比文献报道4- 5均有所提高。离回归偏差(Root MSE): 0.058808决定系数(R- square): 0.9791结论3在本实验室成功构建了具有茶氨酸生物合成能表 7 - GGT 活性响应面分析关键点值力的 - GGT 基因工程菌后,为了将其进一步应用于因素编码值未编码值实际生产中, 首先遇到的问题是其生物过程的优化,葡萄糖/(g/L) A酵母提取物/(g/L) B K2HPO4/(g/L) C- GGT 活性最大预测值/(U/mL)0.1573670.7534660.3668254.
27、41502110.3934186.8836657.100475而培养基是该基因工程菌生长的环境,是其主要的物质和能量来源, 因此, 如何使培养基各因素达到最优值,从而使 - GGT 基因高效表达、酶活有效增加、Y茶氨酸产量和产率显著提高是首要解决的问题。本研究利用了 Plackett- Burman 实验设计快速有效地筛选出影响 - GGT 活性的关键培养基因素,在此基础上, 通过响应面法建立了二次多项回归模型, 确定了关键因素所对应的最优水平及 - GGT 活性的最大预测值。在本研究采用的实验方法和实验条件下,当培养基配方为葡萄糖 10.39 g/L、酵母提取物 6.88 g/L、K2HPO
28、4 7.10 g/L、 蛋 白 胨 10 g/L、 NaCl 10 g/L、MgSO47H2O 1 g/L 时, - GGT 活 性的最大预测值为4.42 U/mL, 进行 6 次重复实验得到 - GGT 活性的平 均实测值为 4.40 U/mL, 两者相当接近, 表明本研究所采用的方法科学合理且快速有效。通过最优培养基 条件下得到的该基因工程菌催化合成茶氨酸的产量为 32.22 g/L, 产率为 52.8%。茶氨酸生物合成基因工 程菌发酵培养基优化的成功, 让笔者更加坚定了对该基因工程菌发酵合成茶氨酸生物过程和工艺体系的进一步探索。参考文献:1 吕毅,郭雯飞,倪捷儿,等.茶氨酸的生理作用及合
29、成J.茶 叶科学,2003,3(1):1- 52 高小红, 袁华, 喻宗沅. 茶氨酸的研究进展J. 化学与生物Alcalase 碱性蛋白酶水解甘薯蛋白的研究吴广辉 1,2,木泰华 1,2*,高愿军 1(1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院, 郑州 450002;2.中国农业科学院农产品加工研究所, 北京 100094)摘要: 通过测定水解度的方法, 研究 Alcalase 碱性蛋白酶对甘薯蛋白的水解效果, 并探讨了 pH、温度、酶用量、底物浓度、水解时间对该酶水解效果的影响。通过正交实验和极差分析确定最佳工艺 条件为温度 45 , 开始的 pH 值 8.0, 底物浓度 3%(w/v), 酶与底
30、物的浓度比 4%(w/v), 水解时间 240min。此外, Alcalase 水解甘薯蛋白可分成 3 个不同分子量的组分。关键词: 甘薯蛋白;Alcalase 碱性蛋白酶;水解度中图分类号: TS 201.2文献标志码: A文章编号: 1005- 9989(2008)07- 0022- 04S tudy on hydrolys is of s we e t pota to prote in with Alca la s e prote a s eWU Guang- hui1,2, MU Tai- hua1,2*, GAO Yuan- jun1(1.Colle ge of Food a nd
31、Biology Engine e ring, Zhe ngzhou Unive rs ity of Light Indus try,Zhe ngzhou 450002; 2.Ins titute of Agro- Food S cie nce a nd Te chnology, Chine s e Aca de my of Agricultura l S cie nce s , Be ijing 100094 )Abstr act: Effe ct of Alca la s e prote a s e on the hydrolys is of s we e t pota to prote i
32、n wa s s tudie d by de te rmina tion of收稿日期:基金项目:作者简介:* 通讯作者2007- 11- 20国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2006AA10Z332)。吴广辉(1981), 男, 河南太康人, 硕士研究生, 研究方向为食品化学与营养。!工程,2004,(1):7- 9李平, 宛晓春, 张正竹. 生 物 合 成 茶 氨 酸 的 研 究 进 展 及 构 建基因工程菌合成茶氨酸的可行性探讨J.食品与发酵 工业,2004,30(1):71- 75Suzuki H, Izuka S, Miyakawa N, et al. Enzymatic
33、 pro - duction of theanine, an umami component of tea, fromglutamine and ethylamine with bacterial- glutamyl -traspeptidaseJ. Enzyme and Microbial Techno- logy,2002,31 (1):884- 889王贤波,成浩,王丽鸳,等.茶氨酸生物合成工程菌构建J.茶叶科学,2007,27(1):61- 66Joseph S, Rephael F. Growing E. coli to high cell density- A historical
34、 perspective on method development J. Bio- technology Advancees,2005,(23):345- 357涂桂云,李敏.基因工程菌高密度发酵工艺研究进展J.工业微生物,2004,34(3):49- 52钟根深, 石炳兴, 吴祖泽. 重组大肠杆菌高密度培养J. 生 物工程杂志,2005,(增刊):27- 31林智, 杨勇, 谭俊峰. 茶氨酸提取纯化工艺研究J. 天然产 物研究与开发,2004,16(5):442- 447Plackett R L, Burman J P. The design of optimum multifatoria
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