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1、实时荧光定量PCR技术,常规PCR与实时荧光定量PCR,常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析,荧光定量PCR常用的三个概念,扩增曲线 荧光阈值 CT值,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Lgliner phase,平台期,扩增曲线,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Lgliner phase,前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号
2、的标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过阈值,Threshold,荧光阈值,平台期,Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Ct value,Ct值,Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性,Ct值的数学原理,理想的PCR反应：Xn=X02n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得:log Xn=log X0(1+Ex)n整理方程式得:log X0=(-log(1+Ex)n+
3、log Xn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：log X0=(-log(1+Ex)C(t)+log Xc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系,n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率,数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。BioerLinegene series荧光定量PCR-NTC实时荧光定量PCR的分类分子信标结果与双标准曲线法相近大多数荧光定量PCR实验的CT值在18-30之间。荧光定量PCR参数解析-CT值realmastermix-引物和扩增产物二级结构的预测乙肝病人血液中HBV的绝对定量1v标准品ii+9v
4、稀释缓冲液，得标准品iii已知在50%的乳腺肿瘤样本中,ERBB2表达异常,因此可以作为一个检测标准样品扩增：正常vs肿瘤设计合适引物，防止非特异性扩增！相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测ERBB2 copies/GAPDH copies对引物特异性要求较高Ct Method:使用内参基因定量所研究样品和参照样品目的基因，-扩增长度50-150 bp(max 400),Cycle number,Ck 104,Ck 102,Sample,Lg of DNA concentration,模板DNA量越多，荧光达到阈值的循
5、环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。,Ct值与模板起始量的关系,qPCR 常用实验方法,简单 成本较低,适用于多重PCR 特异性较好,可进行SNP检测特异性非常好,A,B,C,SYBR Green I 染料法原理,SYBR Green I 是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料,SYBR Green I,热 变 性,引物退火,延伸反应,SYBR Green I 染料法作用机理,问题点：SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。,S
6、YBR Green I染料法问题点与关键点,关键点：设计合适引物，防止非特异性扩增！,将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT),原始图谱,对数图谱,SYBR Green I 染料法融解曲线,SYBR Green I染料法融解曲线,使用方便，不必设计复杂 探针 具有价格优势,优 点,无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低,缺 点,SYBR Green I 染料法优缺点,Taqman探针法原理,5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧
7、光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,Taqman探针法工作机理,1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70，30 bp,5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定：一般为：94，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM4、其他与常规PCR相同,Taqman探针法PCR体系的建立,BioerLinegene series退火温度优化：梯
8、度PCRHealthy RNA模板浓度高，只需较少的扩增循环就可累积足够的产物，产生高过背景的荧光信号，那么CT值就会很早出现，相反CT值则会较晚出现。3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)Export Department Export Management Export Department Export Management E-G+C content 30-80%维基百科/googleCt Method:使用内参基因定量所研究样品和参照样品目的基因，待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍融解曲线分析，出现杂峰
9、其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确ABI-7seriescDNA影响qPCR敏感度5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等将Ct值带入线性方程：融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光一组标准样本 用来生成标准曲线。18-30 cycles大多数荧光定量PCR实验的CT值在18-30之间。相对定量：2Ct法,高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量,优 点,只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针,缺 点,Taqman探针法优缺点,标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成,实时荧光定量PCR的分类分子信标,实时荧光定量PC
10、R的分类分子信标,高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低,优 点,只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高,缺 点,实时荧光定量PCR的分类分子信标,几种方法的应用比较,绝对定量标准曲线由已知浓度的RNA、质粒生成定量未知模板标准样品和未知样品必须同时反应相对定量 Ct Method:使用内参基因定量所研究样品和参照样品目的基因，参照基因可以与目的基因同时反应，也可以单独反应。双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。,绝对定量vs 相对定量,绝对定量,Log（
11、起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,一个目的基因 即需要确定其量值的核酸序列。一组标准样本 用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。标记方法的选择SYBR Green法或探针法均可。实验结果显示扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。,绝对定量分析几要素,拷贝数的计算：待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数样本分子量=碱基数324待测样本拷贝数（copies/ul）
12、=待测样本浓度/样本分子量61014,倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v,质粒标准品稀释方法与拷贝数计算,方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 试 剂：RealMasterMix（Probe）标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤：提取HBV DNA；设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBV DN
13、A的精确copy数。,绝对定量实验例乙肝病人血液中HBV的绝对定量,PMT1-FAM detection-ERBB2双标准曲线法结果分析样本的采集、处理和制备；ERBB2 copies/GAPDH copies实验步骤：提取HBV DNA；Taqman探针法原理cDNA影响qPCR敏感度-Tm(58-600 C)无逆转录酶对照（基因组）待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014Calibrator:可以用带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；输入要查找的蛋白或是基因名称CT值是判断实验成功与否的重要参考乙肝病人血液中HBV的绝对定量Xn：第n次循环后的
14、产物量用No RT Control检验qPCR体系（模板）Real-Time PCR引物序列提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准。Real-Time PCR引物序列999 Slope=-3.双标准曲线法实验结果,BioerLinegene seriesSYBR法实验流程及注意事项延伸时间：产物长度决定Lg of DNA concentrationcDNA合成(两步法 qRT-PCR)951 Slope:-3.可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。-结构特异性使用方便，不必设计复杂Standard curve-不要有连续4个G用No-Template Control(NT
15、C)检验qPCR体系（引物）Reference RNA pools；Healthy RNA已知在50%的乳腺肿瘤样本中,ERBB2表达异常,因此可以作为一个检测标准样品扩增：正常vs肿瘤前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）cDNA影响qPCR敏感度手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；乙肝病人血液中HBV的绝对定量cDNA影响qPCR敏感度,实验数据,乙肝病人血液中HBV的绝对定量,扩增效率（E）计算 E=10-1/slope 1=10-1/-3.29 1=2.011=1.01,标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线,y=-3.29x+40.33 R2=
16、0.9978,乙肝病人血液中HBV的绝对定量,相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.9-1.1,越接近1，越理想。,未知样品拷贝数的计算,将Ct值带入线性方程：,20.5=-3.29 X+40.33,QuantityUnknown=10 6.03=1,071,519 copies,乙肝病人血液中HBV的绝对定量,理论上目的基因表达量分析条件,实际目的基因表达量分析,相对定量的必要性,一个参照样本一个或一个以上的未知样本一个目的基因管家基因用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量重复反应孔 建议每个样本设置三个或三个以上重复孔，以确保统计结果的可信度。标记
17、方法的选择SYBR Green法或探针法均可。实验结果显示扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。一组标准样本（有些分析方法不需要）,相对定量分析几要素,管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、Actin、18S rRNA等,筛选方法,根据文献提供 通过具体实验筛选,相对定量分析管家基因筛选,双标准曲线法 2-Ct法,相对定量分析方法,相对定量分析实例分析,利用TaqMan法研究ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异已知在50%的乳腺肿瘤样本中,ERBB2表达异常,因此可以作为一个检测标准选用GAPDH作为内标基因FAM标记的ERBB2探针VIC标记的GAP
18、DH探针构建标准曲线双重PCR反应阴性对照无RNA对照（空白）无逆转录酶对照（基因组）,双标准曲线法,Color 2-VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,样品扩增：正常vs肿瘤,PMT1-FAM detection-ERBB2,PMT2-VIC detection-GAPDH,肿瘤,肿瘤,正常,正常,双标准曲线法实验结果,ERBB2表达,GAPDH表达,HealthyRNA,TumorRNA,GAPDH,ERBB2,10951052,21302492,9550085730,136000130800,Copies ng/
19、l Total RNA,ERBB2 copies/GAPDH copies,1095/95500=0.0111052/85730=0.012,2130/136000=0.0172492/130800=0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.011,0.018,双标准曲线法结果分析,C(t)=4.41-5.18=-0.770.182-c(t)=1.51-1.93结果与双标准曲线法相近,2 法实验结果,Ct,样品制备,环境要求,定量体系配备,数据分析,RT,上机,浓度确定,SYBR法实验流程及注意事项,cDNA的合成,反应体系优化,试剂选择,样品制备,定量体系配备,数据分析,上
20、机,SYBR法实验流程及注意事项,PMT2-VIC detection-GAPDH重复反应孔 建议每个样本设置三个或三个以上重复孔，以确保统计结果的可信度。平滑曲线，重复性好，灵敏度高委托公司标记，价格较高18-30 cycles荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍Healthy RNAE=10（-1/slope）-1扩增长度：100200bp1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v双标准曲线法结果分析Taqman探针法原理均一的反应液和模板混合物qPCR 常用实验方法病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核log Xn=log X0(1+Ex)nG/C 含量:40
21、-60%BioerLinegene seriescDNA合成(两步法 qRT-PCR)乙肝病人血液中HBV的绝对定量双标准曲线法实验结果输入要查找的蛋白或是基因名称,cDNA合成(两步法 qRT-PCR),qPCR关键cDNA影响qPCR敏感度全长cDNA合成增加qPCR成功率引物Oligo(dT):只识别mRNA，合成cDNA序列靠近3 随机引物:随机合成序列，可能合成非编码RNA，造成定量结果高估两者混合结合两者优点,好的qPCR结果依赖于成功的cDNA合成,定量体系配备,引物设计,浓度确定,环境要求,误差控制,RT,样品制备,数据分析,上机,维基百科/google,目的mRNA序列,Re
22、al-Time PCR引物序列,Blast确定引物特异性,引物设计,SYBR引物设计原则,SYBR-Green引物引物长度18-30 bp，产物长度范围100400bpG/C 含量:40-60%避免引物内含有互补序列(尤其是3端)避免3 端错配3端不能出现连续三个以上的G或C避免3端出现T碱基设计夸内含子引物,TaqMan探针和引物设计,TaqMan探针-Tm 值比引物高10-没有连续相同的碱基-探针位置尽可能地靠近上游 引物-C远远多于G-5端没有G,TaqMan引物-Tm(58-600 C)-15-30 bases in length-G+C content 30-80%-不要有连续4个G
23、-3端不能有连续两个以上的G+C-5端不要有G(A or C preferred)-引物之间的TM相差避免超过2-扩增长度50-150 bp(max 400)-引物跨越内含子,免费的基于网络的设计软件,Primer5（primer3.ut.ee）-引物和双标记水解探针的设计-Tm的计算MFold（http:/mfold.rna.albany.edu）-引物和扩增产物二级结构的预测-二级结构的稳定性(delta G)和融解温度(Tm)BLAST（http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/）-结构特异性,对照设置,阴性对照Negative control:No template(N
24、TC)：检验是否有模板污染No reverse transcriptase(NRT):检验RNA样品中是否有DNA污染No amplification control(NAC):检验是否有聚合酶污染No probe control(NPC):检验荧光污染Buffer:Only contains buffer:检验背景荧光阳性对照Calibrator:可以用带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；质粒DNA；克隆到质粒的cDNA；体外反转录的RNA；Reference RNA pools；来自于特定的生物体样本的RNA或DNA及国际上公认的生物学标准物。Standard curve,反
25、应体系优化,上机,反应条件优化,cDNA的合成,样品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,标准品,待测样本,阳性对照,阴性对照,技能要求,误差控制,仪器介绍,上机（qPCR）,试剂选择,cDNA的合成,样品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,数据分析,仪器介绍,分析方法,上机,cDNA的合成,样品制备,模板准备,相对定量：2Ct法绝对定量：标准曲线法,可靠，准确的数据,SYBR法实验流程及注意事项,qPCR体系的检验,用扩增曲线检验qPCR体系用融解曲线检验qPCR体系用标准曲线检验qPCR体系用No-Template Control(NTC)检验qPCR
26、体系（引物）用No RT Control检验qPCR体系（模板）,扩增曲线,平滑起始无扩增起峰时间正常NTC和NRC无扩增或扩增起峰较晚,CT值是判断实验成功与否的重要参考,荧光定量PCR参数解析-CT值,CT值主要是由反应中模板的初始浓度决定。模板浓度高，只需较少的扩增循环就可累积足够的产物，产生高过背景的荧光信号，那么CT值就会很早出现，相反CT值则会较晚出现。大多数荧光定量PCR实验的CT值在18-30之间。CT值在30-35个循环之内出现，需要多次重复试验以判断数据的准确性，然后再判断是否有目的基因的扩增。CT值在35个循环之后出现，可以认为反应失败。,溶解曲线分析,呈现单峰峰的宽度较
27、小NTC和NRC均无较高的峰出现,荧光定量PCR-扩增效率,r2:0.951 Slope:-3.58-3.10E:90%110%,r2=0.999 Slope=-3.364E=10（-1/slope）-1,荧光定量PCR-NTC,NTCNTC的最佳状况NTC不为零,荧光定量PCR标准数据参考范围,MIQE qPCR国际标准,提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准。对QPCR的术语；概念；研究与临床应用；样本的采集、处理和制备；核酸的质量控制；反转录；QPCR过程；数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。,CT值是判断实验成功与否的重要参考双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基
28、因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。-Tm(58-600 C)SYBR Green I 染料法优缺点-Tm的计算重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。样品扩增：正常vs肿瘤-引物和双标记水解探针的设计Healthy RNACT值是判断实验成功与否的重要参考果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将一个或一个以上的未知样本相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；-Tm(58-600 C)2492/130800=0.Real-Time PCR引物序列待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014BioerLinegene series大多数荧光定量PCR实验的CT值在18-30之间。设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量PCR参数解析-CT值,Report,Thank you for your attention!,
