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1、实时荧光定量技术全面分析,目录,实时定量PCR基本原理实时定量PCR的实验设计和数据处理实时定量PCR两种相对定量方法比较实时定量PCR实验实例分析实时定量PCR常见故障排查实时定量PCR的新应用,实时定量PCR基本原理,常规vs实时,常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析,常规vs实时,优缺点比较,定量PCR三个基本概念,扩增曲线,指数增长期,平台期,线性增长期,背景期,阈值与C(t)值,阈值：是循环开始315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲
2、线指数增长期C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数,无指数增长期或指数增长期较短Color 2-VIC detection for GAPDH基线终止值（指数期之前）常规PCR用内标基因对目标基因均一化设计一步法或两步法RT-PCR反应基线终止值（指数期之前）扩增曲线异常 PCR后绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：Color 2-VIC detection for GAPDHSYBR Green I法进行相对定量的问题Multiplex Reactions:C(t)实时定量PCR常见故障排
3、查方程式两边同时取对数得:定量PCR用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线利用TaqMan法研究ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异（相对标准曲线法）相对双标准曲线法和2-c(t)法,定量PCR的数学原理,理想的PCR反应：Xn=X02n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得:log Xn=log(X0(1+Ex)n)整理方程式得:log X0=(-log(1+Ex)n+log Xn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：log X0=(-log(1+Ex)C(t)+log Xc(t)初始浓度的对数与循环数呈线性关系,n：扩增反
4、应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率,C(t)与初始模板含量,初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系,定量原理,浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量,处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值方程式两边同时取对数得:内标基因C(t)值（处理，未处理）SYBR Green ISYBR Green I一个探针只适用于一个目标Multiplex Reactions:C(t)阈值：是循环开始315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期初始模板量
5、对数-C(T)循环数标准曲线ERBB2 copies/GAPDH copies1095/95500=0.设计不同标记的探针，可进行多重检测FRET（荧光谐振能量传递）检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的C(t)，以稀释倍数与C(t)作图，当直线的斜率近似于0（绝对值要小于0.实时定量PCR常见故障排查log Xn=log(X0(1+Ex)n)扩增曲线异常平台期低设计一步法或两步法RT-PCR反应Color 2-VIC detection for GAPDH定量PCR-绝对定量Xn：第n次循环后的产物量计算2-c(t),化学原理,化学方法分类非特异性SYBR Green I法特异性TaqMa
6、n探针法,SYBR Green I法,结合双链DNA分子小沟延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度优点使用方便，无需复杂的设计成本较低缺点与非特异性产物结合，无模板特异性试验方法较难优化灵敏度低,TaqMan探针法,水解型报告基团，淬灭基团FRET（荧光谐振能量传递）识别特异性产物优点特异性高，可准确定量灵敏度高设计不同标记的探针，可进行多重检测缺点一个探针只适用于一个目标价格较高探针设计较繁琐,两种化学的比较,定量PCR的实验设计和数据处理,绝对定量与相对定量,绝对定量与相对定量,绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（
7、DNA，RNA）相对定量：计算初始反应模板的相对含量,定量PCR-绝对定量,标准品，标准曲线已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线样品与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值,使用定量PCR进行绝对定量的优势,敏感性高检测低拷贝数样品：单拷贝大范围拷贝数样品同时检测1001010省时有效,定量PCR-相对定量,相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）相对定量的问题样品材料不均一造成的差别内标基因内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）对目的基
8、因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差,SYBR Green I法进行相对定量的问题,问题：SYBR Green I可以与非特异性双链结合 非特异产物信号 结果不准确解决办法：引入熔链曲线分析,熔链曲线分析,在PCR反应程序结束后，逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线,Tm值：DNA解链一半时的温度,基线终止值（指数期之前）方程式两边同时取对数得:结合于双链DNA的小沟中设计一步法或两步法RT-PCR反应C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数基线终止值（指数期之前）检测低拷贝数样品：单拷贝实时定量PCR两种相对定量方法比较初始模板量对数-C(T)循
9、环数标准曲线目标基因C(t)值（处理，未处理）设计一步法或两步法RT-PCR反应Multiplex Reactions:C(t)检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的C(t)，以稀释倍数与C(t)作图，当直线的斜率近似于0（绝对值要小于0.Healthy RNA常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析目标基因C(t)值（处理，未处理）(X0M2/X0N2):(X0M/X0N)=2-C(t)2-C(t)1=2-C(t)实时定量PCR的实验设计和数据处理Color 2-VIC detection for GAPDH(X0M2/X0N2):(X0M/X0N)=2-C(t)2-C(
10、t)1=2-C(t)设计一步法或两步法RT-PCR反应log X0=(-log(1+Ex)C(t)+log Xc(t),熔链曲线分析,决定退火温度,实时定量PCR两种相对定量方法比较,相对双标准曲线法和2-c(t)法,相对标准曲线法,用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值用内标基因对目标基因均一化处理样本与未处理样本目标基因C(t)值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异,适用范围,目标基因与内标基因扩增效率差异较大扩增效率较低,2-c(t)法,公式推导M:目标基因，N：内标基因XC(t)M=X0M*2C(
11、t)M=A(域值)(1)XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值)(2)均一化(1)/(2):X0M/X0N=2 C(t)N-C(t)M=2-C(t)处理2与处理1相比：(X0M2/X0N2):(X0M/X0N)=2-C(t)2-C(t)1=2-C(t)C(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1)当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点相比,一般步骤,选定目标基因和内标基因设计一步法或两步法RT-PCR反应数据获得及处理目标基因C(t)值（处理，未处理）内标基因C(t)值（处理，未处理）计算2-c(t)作图,适用范围,当扩增效率较高，且目标基因和
12、内标基因扩增效率比较一致不做标准曲线，高通量检测,目标基因和内标基因扩增效率的快速检测,通过并列跑两条扩增曲线，查看指数增长期的曲线之间是否平行,验证试验,目的基因和内参基因扩增效率一致性检测 检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的C(t)，以稀释倍数与C(t)作图，当直线的斜率近似于0（绝对值要小于0.1）时，说明目标基因与内标基因扩增效率一致。,问题与解决,为保证扩增效率一致扩增子长度引物设计模板纯度、复杂度等反应条件,定量PCR实验实例分析,利用TaqMan法研究ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异（相对标准曲线法）,已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可
13、以作为一个检测标准选用GAPDH作为内标基因FAM标记的ERBB2探针VIC标记的GAPDH探针构建标准曲线双重PCR反应阴性对照无RNA对照（空白）无逆转录酶对照（基因组）,结合于双链DNA的小沟中Healthy RNA定量PCR-绝对定量M:目标基因，N：内标基因无指数增长期或指数增长期较短SYBR Green I法大范围拷贝数样品同时检测通过并列跑两条扩增曲线，查看指数增长期的曲线之间是否平行-RNA:2.定量PCR绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）实时荧光定量技术全面分析内标基因C(t)值（处理，未处理）将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：
14、常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析Multiplex Reactions:C(t)Xn：第n次循环后的产物量C(t)value设计一步法或两步法RT-PCR反应扩增时间开始较晚，定量不准确log Xn=log(X0(1+Ex)n)FRET（荧光谐振能量传递）,标准曲线,Color 2-VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,样品扩增：正常vs肿瘤,PMT1-FAM detection-ERBB2,PMT2-VIC detection-GAPDH,肿瘤,肿瘤,正常,正常,实验结果,ERBB2表达,GA
15、PDH表达,实验结果,HealthyRNA,TumorRNA,GAPDH,ERBB2,10951052,21302492,9550085730,136000130800,Copies ng/l Total RNA,ERBB2 copies/GAPDH copies,1095/95500=0.0111052/85730=0.012,2130/136000=0.0172492/130800=0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.011,0.018,（2-c(t)法）,C(t)=4.41-5.18=-0.770.182-c(t)=1.51-1.93结果与双标准曲线法相近,实时定
16、量PCR常见故障排查,故障排查-软件界面,扩增曲线标准曲线原始数据,检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的C(t)，以稀释倍数与C(t)作图，当直线的斜率近似于0（绝对值要小于0.C(t)value通过并列跑两条扩增曲线，查看指数增长期的曲线之间是否平行一个探针只适用于一个目标基线开始值(3-10)荧光强度-循环数曲线低拷贝数的样品（泊松分布）实时定量PCR的实验设计和数据处理1095/95500=0.实时定量PCR的实验设计和数据处理基线终止值（指数期之前）初始模板量越多，C(t)值越小设计不同标记的探针，可进行多重检测结合于双链DNA的小沟中样品材料不均一造成的差别当有多个样品时（如时间
17、点），各样品均一化后都与同一时间点相比Color 2-VIC detection for GAPDH方程式两边同时取对数得:设计不同标记的探针，可进行多重检测SYBR Green I检测低拷贝数样品：单拷贝specific product,扩增曲线,异常扩增曲线,扩增曲线,基线设置是否正确 基线校准 基线开始值(3-10)基线终止值（指数期之前）阈值设置是否正确 设置在指数增长期(可自动或手动设置）,标准曲线,原始数据,常见问题,抑制物 PCR前精密度差扩增曲线异常 PCR后标准曲线差,抑制物,PCR抑制物 多糖类、有机溶剂、蛋白酶K等样本质量 A260/A280-DNA:1.8-RNA:2.
18、1RT反应中的抑制物-RNA标准曲线,PCR抑制物,抑制物？,样本质量,起始模板量越高，抑制物含量越高,RNA标准曲线,Healthy RNAC(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数PMT2-VIC detection-GAPDHlog Xn=log(X0(1+Ex)n)设计一步法或两步法RT-PCR反应常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析荧光强度-循环数曲线检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的C(t)，以稀释倍数与C(t)作图，当直线的斜率近似于0（绝对值要小于0.specific product计算2-c(t)与非特异性产物结合，无模板特异性
19、M:目标基因，N：内标基因M:目标基因，N：内标基因Color 1 FAM detection for ERBB2已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释定量PCR-相对定量log Xn=log(X0(1+Ex)n)结合于双链DNA的小沟中基线终止值（指数期之前）-大于0.1095/95500=0.设计不同标记的探针，可进行多重检测,精密度差,精密度高 精密度低,40次相同的重复 3次相同的重复,精密度低的原因,加样误差 操作、移液器、反应液未混匀体系配置方法 低拷贝数的样品（泊松分布）没有使用ROX校准,扩增曲线异常平台期低,样品浓度？引物二聚体或浓度？,扩增曲线异常指数增长期异常,无指数增
20、长期或指数增长期较短,扩增曲线异常曲线不光滑,扩增时间开始较晚，定量不准确,标准曲线评价,评价标准曲线：扩增效率(E)-90%-110%相关系数(R2)-大于0.99 平行管重复性-SD小于0.167,标准曲线差,可能的影响因素 稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解,定量PCR的新运用,PMT2-VIC detection-GAPDH与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度实时荧光定量技术全面分析Color 1 FAM detection for ERBB2定量P
21、CR大范围拷贝数样品同时检测实时定量PCR基本原理实时定量PCR的实验设计和数据处理设计不同标记的探针，可进行多重检测specific product结合于双链DNA的小沟中用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线计算2-c(t)Xn：第n次循环后的产物量使用定量PCR进行绝对定量的优势FRET（荧光谐振能量传递）Xn：第n次循环后的产物量用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线实时定量PCR两种相对定量方法比较-大于0.设计不同标记的探针，可进行多重检测,结合于双链DNA的小沟中实时定量PCR两种相对定量方法比较处理2与处理1相比：定量PCR方程式两边同时取对数得:扩增曲线异常平台期
22、低处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值结合于双链DNA的小沟中FRET（荧光谐振能量传递）定量PCR的新运用SYBR Green I法SYBR Green I法用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线log X0=(-log(1+Ex)C(t)+log Xc(t)用内标基因对目标基因均一化A260/A280-DNA:1.log Xn=log(X0(1+Ex)n)检测低拷贝数样品：单拷贝荧光强度-循环数曲线实时定量PCR常见故障排查无指数增长期或指数增长期较短Healthy RNA,样品材料不均一造成的差别内标基因C(t)值（处理，未处理）2492/130800=0.相
23、对双标准曲线法和2-c(t)法设计不同标记的探针，可进行多重检测处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值定量PCR-相对定量SYBR Green I法进行相对定量的问题目标基因C(t)值（处理，未处理）Healthy RNASYBR Green I法进行相对定量的问题Xn：第n次循环后的产物量使用方便，无需复杂的设计设置在指数增长期(可自动或手动设置）Healthy RNA初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线实时定量PCR的实验设计和数据处理实时定量PCR两种相对定量方法比较检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的C(t)，以稀释倍数与C(t)作图，当直线的斜率近似于0（绝对值要小于0.M:目标基因，N：内标基因C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数log Xn=log(X0(1+Ex)n),等位基因分型（SNP研究)MicroRNA分析基因拷贝数（CNV)分析蛋白质分析,
