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1、色谱纯度分析方法验证报告目录设备验证方案历史记录色谱纯度分析方法验证报告批准 -31. 验证目的 -42. 色谱纯度分析方法 -42.1 仪器 -42.2 试剂 -42.3 标准品 -42.4 色谱条件 -42.5 溶液配制 -52.6 进样操作 -53. 方法验证 -63.1 专属性 -63.2 系统适用性试验 -93.3 精密度 -93.4 线性及范围 -113.5 准确度 -173.6 检测限及定量限 -204验证评价及结论 -215. 附件 -21色谱纯度分析方法验证报告批准对本验证方案批准表示同意其验证项目和可接受标准、验证方法和本方案内的各种表格格式、内容。在执行本方案的过程中可能
2、会遇到阻碍本方案精确地完成的缺陷。较小的偏差可以在偏差报告内陈述。较大的偏差，如，方法的修改，测试/评估参数，接受标准等只有在附带有经过批准的补充材料的情况下才予以承认。所有经批准的偏差报告和补充材料都应附在批准前的验证报告内。方案起草签名日期质检中心方案审核签名日期质检中心QC总工程师质量部QA方案批准签名日期质量副总1摘要我们按照USP30专论的方法测定的色谱纯度。方法的原理是采用HPLC方法，在233nm检测波长下测定，以为参考标准，进行色谱纯度的定量分析。该方法用于原料药在放行及稳定性试验中色谱纯度的测定。经评价，实验室色谱纯度的条件，包括色谱柱、流动相、检测波长、进样量、浓度等条件完
3、全与USP专论规定的一致。杂质A, C, D，以及杂质XA、杂质XB和杂质XC是实际存在和潜在的杂质。为了评价实验室的仪器、人员、环境等能否满足色谱纯度测定的要求，按照ICH指南Q2A和Q2B的要求，对分析方法进行了验证，验证的项目包括专属性、系统适用性试验、精密度、线性、范围、准确度、定量限和检测限, 验证结果表明，每个验证项目均符合验证标准。USP色谱纯度的分析方法适合于原料药中杂质的测定和控制。验证结果摘要如下：a. 专属性：溶剂对杂质的测定没有干扰，与相邻杂质XA和杂质D的分离度依次为21.1和13.2, 较相邻的杂质D和杂质A的分离度为1.8，杂质XB和XC的分离度为1.6，均大于1
4、.5，表明与每个杂质以及每个杂质之间分离度均符合要求。b. 系统适用性试验：在系统适用性溶液的色谱图中，3-苯甲酰基苯甲酸和的分离度R为13.3，大于4；以峰计算色谱柱的理论塔板数N为20328，大于2250；峰的拖尾因子T为 0.83，小于2.0；标准溶液连续进样6次，其主峰面积的RSD为0.51%，小于5%。c. 精密度：标准溶液重复进样6次，在重复性项下，杂质C, 杂质XA, , 杂质D, 杂质A, 杂质XB和杂质XC峰面积的RSD依次为0.24%, 0.41%, 0.51%, 0.54%, 0.21%, 1.6%和0.86%, 均小于5%；在中间精密度项下测得的RSD依次为0.20%,
5、 0.23%, 0.60%, 0.60%, 0.24%, 1.1%和0.49%, 均小于5%；F-test结果表明，每个组分的F值均小于F0值5.05, 表明方法的中间精密度和重复性之间的精密度无显著性差异。d. 线性和范围：杂质A的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为Y=153.713X-0.214，相关系数为0.99996；杂质C的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为Y=62.854X-0.236，相关系数为0.9999; 杂质D的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为Y=27.520X-0.423，相关系数为0.9999; 杂质XA的含量在0.02
6、%0.24%的范围时，它的线性方程为Y=86.007X-0.725，相关系数为0.9999; 杂质XB的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为Y=13.160X-0.325，相关系数为0.9997; 杂质XC的含量在0.02%0.25%的范围时，它的线性方程为Y=65.240X-1.546，相关系数为0.9998; 代表其它杂质的含量在0.02%0.25%的范围时，它的线性方程为Y=33.579X-0.558，相关系数为0.9998; 每个杂质的相关系数均大于0.999, 表明它们的峰面积与浓度均呈线性关系。e. 准确度：杂质A、杂质C、杂质D、杂质XA、杂质XB、杂质XC和的回收
7、率依次为99.4%, 99.2%, 98.5%, 99.0%, 98.7%, 98.5%和100.5%，回收率的RSD依次为1.2%, 1.8%, 1.4%, 1.8%, 2.9%, 2.5%和2.4%；每个杂质的回收率均介于95.0%105.0%之间。f. 定量限和检测限：杂质A、杂质C、杂质D、杂质XA、杂质XB、杂质XC和的检测限依次为0.0002%, 0.0002%, 0.002%, 0.0004%, 0.005%, 0.001%, 它们的定量限依次为0.001%, 0.001%, %, 0.002%, 0.02%, 0.005%,结果表明，方法的灵敏度适合杂质的检测和控制。2. 分析
8、方法USP30专论2.1 仪器：高效液相色谱仪 Agilent 1100 HPLC2.2试剂：a. 乙腈 (色谱纯)b. 磷酸二氢钾 (分析纯)c. 纯化水2.3 标准品：a. 标准品b. 3-苯甲酰基苯甲酸2.4色谱条件：a) 色谱柱：YMC Pack ODS-A，4.6mm150mm，3m；b) pH3.5缓冲液：称取68.0g磷酸二氢钾，用水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调pH值为3.500.05，过滤。c) 流动相：水-乙腈- pH3.5缓冲液=550:430:20配制方法：用适宜的量筒分别量取过滤的水550ml，乙腈430ml和pH3.5缓冲液20ml，于一合适的试剂瓶中，充分混匀
9、。在超声波上脱气10分钟。也可按照待测样品的数量，按照比例配制适量的流动相。d) 检测波长：233nm；e) 流速：1.0ml/min；f) 进样量：20l。2.5 溶液制备a) 系统适用性溶液：量取0.5ml标准贮备溶液和3-苯甲酰基苯甲酸贮备溶液1.0ml至10ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混合均匀。和3-苯甲酰基苯甲酸的浓度依次约为0.01mg/ml和0.005mg/ml。3-苯甲酰基苯甲酸贮备溶液：称取3-苯甲酰基苯甲酸标准品5.0mg，置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，混合均匀。b) 标准溶液：标准贮备溶液：称取标准品约10.0mg，置50ml容量瓶中，加流动相溶解
10、并稀释至刻度，混合均匀。精密量取1.0ml至100ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混合均匀。浓度约为0.002mg/ml。c) 供试溶液：称取样品约100mg，精密称定，置100ml棕色容量瓶中，加适量流动相，用超声波使溶解，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，混合均匀。该溶液制备应避光操作。2.6 进样操作2.6.1仪器准备按照高效液相色谱仪操作规程准备仪器，设定流速为1.0ml/min，设定检测器波长为233nm。待仪器平衡后，开始进样操作。2.6.2系统适用性试验：系统平衡后，取系统适用性溶液进样，记录色谱图，3-苯甲酰基苯甲酸和的相对保留时间依次为0.8和1.0；3-苯甲酰基苯甲酸和的分
11、离度R至少为4。以峰计算色谱柱的理论塔板数N，应不少于2250；峰的拖尾因子T，不大于2.0。标准溶液连续进样6次，记录色谱图，其主峰面积的RSD5%。2.6.3空白测试：取流动相进样，记录色谱图。在样品的测试中忽略溶剂峰。2.6.4样品测定取供试品溶液进样，记录色谱图至主峰保留时间的7倍，以峰面积计算杂质的含量。2.6.5计算公式：按公式 (1)计算中单个杂质含量；按公式 (2)计算中总杂质的含量。单个杂质含量 (%) 公式 (1)总杂质含量 (%) 公式 (2)式中：WS标准品的重量，mg；Wi的样品的重量，mg；Ai样品色谱图中单个杂质的峰面积；As标准溶液中主峰的峰面积。PUSP标准品
12、的含量样品色谱图中总杂质的峰面积，等于A总面积A。2.6.6 结果判定：供试品中单个杂质不大于0.2%，总杂质不大于1.0%。3方法验证3.1专属性3.1.1空白测试:取溶剂流动相进样，记录色谱图，做为空白，确定溶剂对杂质测定有无干扰，在样品测定图谱中溶剂峰应忽略。色谱图见KP0-BLANK000000.D。3.1.2单个杂质的定性3.1.2.1杂质定性溶液：依次取“3.4.1.1杂质标准贮备液”项下杂质A、杂质C、杂质D和杂质XA、杂质XB、杂质XC的标准贮备溶液2.0ml，各至一个25ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混合均匀。3.1.2.2取每个杂质溶液分别进样，记录色谱图。记录每个杂质
13、的保留时间，用保留时间对每个杂质进行定性，结果填写在表1-1。按照保留时间顺序，杂质C, XA, D, A, XB, XC的保留时间依次为2.218min, 5.168min, 11.402min,12.019min, 17.191min, 17.960min。它们的色谱图见KP0-000001.D，KP0-000003.D，KP0-000005.D，KP0-000006.D，KP0-000008.D，KP0-000009.D。表1-1 各杂质的定性杂质名称浓度（g/ml）保留时间（min）杂质C8.02.218杂质D8.211.402杂质A8.012.0193.1.3 杂质和的分离度测试以重
14、复性项下的色谱图进行评价，记录各组分的出峰顺序和保留时间，并计算相邻组分之间的分离度R，数据见表1-2。色谱图见KP0-000014.D。3.1.4加入已知杂质的分离度测试3.1.4.1溶液制备称取样品10mg，加入线性项下标准贮备溶液(10g/ml) 2.0ml, 再加入流动相溶解并稀释至10ml，混合均匀。3.1.4.2测定：取该溶液进样，记录色谱图，记录各组分的出峰顺序和保留时间，计算它们的相对保留时间(RRT)（为1.0）和相邻组分之间的分离度R，数据见表1-3。色谱图见KP0-000026.D。表1-2 杂质和分离度测试出峰顺序名称保留时间（min）分离度R1杂质C2.218-2杂质
15、XA5.21621.037.78612.44杂质D11.47613.35杂质A12.0691.8表1-3 加入已知杂质的分离度测试出峰顺序名称保留时间（min）RRT分离度R1杂质C2.2120.28-2杂质XA5.2100.6721.137.7951.012.64杂质D11.4751.4713.25杂质A12.0661.551.83.1.6专属性评价标准1) 溶剂对杂质的测定无明显干扰；2）杂质A和杂质D的分离度不小于1.0；其它每个相邻组分之间的分离度R均应大于1.5；3.1.7 验证结果及评价 溶剂对杂质的测定没有干扰，与相邻杂质XA和杂质D的分离度依次为21.1和13.2, 较相邻的杂
16、质D和杂质A的分离度为1.8，杂质XB和XC的分离度为1.6，均大于1.5，表明与每个杂质以及每个杂质之间分离度均符合要求。方法的专属性符合验证标准。3.2系统适用性试验3.2.1按照色谱纯度分析方法进行：3.2.2分离度：系统平衡后，取系统适用性溶液进样，记录色谱图，3-苯甲酰基苯甲酸和的相对保留时间依次约为0.8和1.0；计算3-苯甲酰基苯甲酸和的分离度。以峰计算色谱柱的理论塔板数N和拖尾因子T。色谱图见KP0-000039.D。3.2.4重复性标准溶液连续进样6次，记录色谱图，计算主峰面积的RSD。测定数据和结果见表2-1。色谱图见KP0-000040.DKP0-000045.D。3.2
17、.3验证合格标准1） 以峰计算色谱柱的理论塔板数N，应不少于2250；2） 峰的拖尾因子T，不大于2.0；3） 3-苯甲酰基苯甲酸和的分离度R至少为4；4） 标准溶液连续进样6次，其主峰面积的RSD5%。3.2.4系统适用性试验结果及评价： 在系统适用性溶液的色谱图中，3-苯甲酰基苯甲酸和的分离度R为13.3，大于4；以峰计算色谱柱的理论塔板数N为20328，大于2250；峰的拖尾因子T为 0.83，小于2.0；标准溶液连续进样6次，其主峰面积的RSD为0.51%，小于5%。方法的系统适用性试验符合验证标准。表2-1 系统适用性试验数据No.123456平均值峰面积67.9368.3867.7
18、668.7568.1668.1268.18标准偏差S0.35RSD0.51%分离度R13.3理论塔板数N20328拖尾因子T0.833.3 精密度3.3.1 重复性3.3.1.1以方法规定的色谱条件，取线性项下No.5线性标准溶液，连续进样6次，记录色谱图，计算各组分峰面积的平均值、标准偏差S和RSD。以RSD评价方法的重复性。数据及结果见表3-1。色谱图见KP0-000014.DKP0-000019.D。3.3.1.2验证合格标准：标准溶液连续重复6次进样，各组分峰面积的相对标准偏差 RSD5%。3.3.1.3重复性验证结果及评价标准溶液重复进样6次，杂质C, 杂质XA, , 杂质D, 杂质
19、A峰面积的RSD依次为0.24%, 0.41%, 0.51%, 0.54%, 0.21%, 1.6%和0.86%, 均小于5%, 方法的重复性符合标准。3.3.2 中间精密度另日，由另外一个化验员，按照线性项下No.5线性标准溶液的制备方法配制相同浓度的溶液，在相同的仪器上连续进样6次，记录色谱图。计算各组分峰面积的平均值、标准偏差S和RSD，以RSD评价方法的中间精密度，数据及结果见表3-2。色谱图见KP0-000014.DKP0-000019.D。3.3.2.2验证合格标准：标准溶液连续重复6次进样，各组分峰面积的相对标准偏差 RSD5%。3.3.2.3中间精密度验证结果及评价标准溶液重复
20、进样6次，杂质C, 杂质XA, , 杂质D, 杂质A峰面积的RSD依次为0.20%, 0.23%, 0.60%, 0.60%, 0.24%, 1.1%和0.49%, 均小于5%；方法的中间精密度符合标准。3.3.3精密度的显著性评价使用F-检验的方法，评价在精密度方面，方法的重复性和中间精密度有无显著性差异。3.3.3.1步骤(1) 取各组分重复性和中间精密度项下的峰面积的标准偏差S;(2) 选择显著性水平=0.05；(3) 从表3-1和表3-2获得峰面积的标准偏差S，确定S1和S2（S1S2）；(4) 计算 F 值， F = S12/S22；(5) 计算自由度 (n2-1,n1-1)=(5,
21、 5)，n2n16；(6) 查阅在=0.05，自由度为(5,5)，单侧检验的F05.05；(7) 数据和结果见表3-3。3.3.3.2验证合格标准每个组分的F应小于F0，即表明方法的重复性和中间精密度之间无显著性差异。3.3.3.3验证结果及评价每个组分的F应小于F0，表明方法中间精密度和重复性之间的精密度无显著性差异。3.3.4精密度验证结果及评价标准溶液重复进样6次，在重复性项下，杂质C, 杂质XA, , 杂质D, 杂质A, 杂质XB和杂质XC峰面积的RSD依次为0.24%, 0.41%, 0.51%, 0.54%, 0.21%, 1.6%和0.86%, 均小于5%；在中间精密度项下测得的
22、RSD依次为0.20%, 0.23%, 0.60%, 0.60%, 0.24%, 1.1%和0.49%, 均小于5%；F-test结果表明，每个组分的F值均小于F0值5.05, 表明方法的中间精密度和重复性之间的精密度无显著性差异。方法的精密度符合验证标准。表3-1 重复性试验数据组分峰面积平均值SRSD123456杂质C125.75126.03126.08126.63126.27125.99126.130.2970.24%杂质XA 170.09170.75170.79170.99171.92169.98170.750.7010.41%72.3071.5871.8372.1872.6372.2
23、272.120.3690.51%杂质D55.7255.8155.8056.0155.9955.1855.750.3020.54%杂质A308.44307.59308.16308.36307.76306.72307.840.6410.21%表3-2 中间精密度试验数据组分峰面积平均值S RSD123456杂质C126.28126.15126.07126.60126.30126.70126.350.2490.20%杂质XA 170.92171.07171.30170.39171.52171.17171.060.3870.23%72.7072.1872.5871.6772.1571.6772.160
24、.4360.60%杂质D56.5756.3355.6156.3556.1256.4356.240.3400.60%杂质A309.00308.71308.40309.97308.92310.23309.200.7280.24%表3-3 重复性和中间精密度有无显著性差异的评价组分名称重复性的S中间精密度的SF=S12/S22（S1S2）接受标准F0结论杂质C0.2970.2491.425.05合格杂质XA 0.7010.3873.285.05合格0.3690.4361.405.05合格杂质D0.3020.3401.275.05合格杂质A0.6410.7281.295.05合格3.4 线性及范围3.
25、4.1 溶液制备3.4.1.1标准贮备液分别精密称取以下标准品：杂质A、杂质C、杂质D、杂质XA、杂质XB、杂质XC和标准品适量，分别至一个容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，混合均匀，得到每个组分的标准贮备液。每个成分的浓度均约为0.10mg/ml。（备注：为保证线性范围，浓度应充分精确，并根据含量折纯）。3.4.1.2标准贮备溶液(a)：分别量取每个杂质和的标准贮备液各5.0ml,至一个50.0ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混合均匀。每个组分的浓度均约为10g/ml。3.4.1.3标准溶液分别取标准贮备溶液(a) 0.5ml, 1.0ml, 2.0ml, 4.0ml, 5.0ml, 6
26、.0ml各至一个25.0ml容量瓶，用流动相稀释至刻度，混合均匀，得到No.1No.6标准溶液。每个杂质和的浓度范围均约为0.24 g/ml，相当于杂质含量在0.02%0.24%。3.4.2 测定分别取No.1No.6标准溶液，分别进样，每个浓度连续进2次，记录色谱图至最后一个组分出峰为止。浓度、峰面积及实验结果见表4-1表4-7。3.4.3 线性回归以各组分峰面积平均值对其浓度（g/ml），使用origin 5.0软件进行线性回归，得到各组分的标准曲线，线性方程及相关系数R。线性测试数据及结果见表4-14-7。3.4.4验证合格标准：在每个组分的线性范围内，各组分峰面积与浓度均应呈线性关系，
27、相关系数R0.999。3.4.5线性验证结果及评价杂质A的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为Y=153.713X-0.214，相关系数为0.99996；杂质C的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为Y=62.854X-0.236，相关系数为0.9999; 杂质D的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为Y=27.520X-0.423，相关系数为0.9999; 杂质XA的含量在0.02%0.24%的范围时，它的线性方程为Y=86.007X-0.725，相关系数为0.9999; 代表其它杂质的含量在0.02%0.25%的范围时，它的线性方程为Y=33.579X
28、-0.558，相关系数为0.9998; 每个杂质的相关系数均大于0.999, 表明它们的峰面积与浓度均呈线性关系。方法的线性和范围符合验证标准。表4-1 线性测试的数据和结果溶液No.杂质 A浓度(g/ml)峰面积平均峰面积1210.200031.0330.9631.0020.400062.7462.3362.5330.8000121.46120.51120.9941.600243.78245.15244.4552.000309.36306.51307.9462.400367.92370.63369.28范围(g/ml)0.22.4范围(%)0.020.24线性方程Y=153.713X-0.2
29、14相关系数R0.99996回归直线Linear Regression for Data of Impurity A:Y = A + B * XParameterValueError-A-0.214131.00483B153.712810.67848-RSDNP-0.999961.3626160.0001-表4-2 线性测试的数据和结果溶液No.杂质 C浓度(g/ml)峰面积平均峰面积1210.200012.7412.7212.7320.400025.6725.6325.6530.800048.7948.9948.8941.60099.3599.6499.5052.000126.15125.5
30、7125.8662.400150.63151.51151.07范围(g/ml)0.22.4范围(%)0.020.24线性方程Y=62.854X-0.236相关系数R0.9999回归直线Linear Regression for Data of Impurity C:Y = A + B * XParameterValueError-A-0.236050.64896B62.853550.43819-RSDNP-0.99990.8800360.0001-3.5 准确度3.5.1 以中间精密度项下No.5线性标准溶液为标准，按照以下公式，计算线性项下No.2No.6溶液中每个组分的回收率，并计算平均回
31、收率。未知杂质的回收率以的进行评价。 回收率测试数据及结果见表5-15-7。3.5.2计算公式：回收率（%）=注：Ai：No.2No.6线性标准溶液中每个组分的平均峰面积； ASi：No.5线性标准溶液中每个组分的平均峰面积；Ci：No.2No.6线性标准溶液中每个组分的浓度，g/ml.CSi：No.5线性标准溶液中每个组分的浓度，g/ml.3.5.3可接受标准：每个组分的平均回收率：95.0%105.0%。3.5.4准确度验证结果及评价杂质A、杂质C、杂质D、杂质XA、杂质XB、杂质XC和的回收率依次为99.4%, 99.2%, 98.5%, 99.0%, 98.7%, 98.5%和100.
32、5%，回收率的RSD依次为1.2%, 1.8%, 1.4%, 1.8%, 2.9%, 2.5%和2.4%；每个杂质的回收率均介于95.0%105.0%之间。方法的准确度符合验证标准。表5-1杂质A回收率测定数据和结果标准溶液浓度CSi (g/ml)2.000标准平均峰面积ASi309.20溶液No.23456浓度Ci (g/ml)0.40000.80001.6002.0002.400平均峰面积Ai62.53120.99244.45307.94369.28回收率（%）101.197.8298.8299.5999.53平均回收率（%）99.4回收率的RSD1.2%表5-2杂质C回收率测定数据和结果
33、标准溶液浓度CSi (g/ml)2.000标准平均峰面积ASi126.35溶液No.23456浓度Ci (g/ml)0.40000.80001.6002.0002.400平均峰面积Ai25.6548.8999.50125.86151.07回收率（%）101.596.7398.4499.6199.64平均回收率（%）99.2回收率的RSD1.8%3.6 检测限及定量限3.6.1 溶液：取“线性及范围”项下No.1No.2标准溶液，逐步稀释，得到适当浓度的溶液。3.6.2 测定在规定的色谱系统下，分别进样，记录色谱图。当待测组分的信噪比为23倍时，对应的浓度为该组分的最小检测浓度(C1，g/ml)
34、；当待测组分的信噪比为1020倍时，对应的浓度为该组分的最小定量浓度(C2，g/ml)。测试数据及结果见表6-1。3.6.3计算公式： 检测限LOD(%)= 最小检测浓度(C1)10-3100%/1.0mg/ml定量限LOQ(%)= 最小定量浓度(C2)10-3100%/1.0mg/ml信噪比式中：1.0mg/ml：为方法中样品的浓度。 hi：测试溶液中单个溶剂的峰高； hb：基线噪声的峰高.3.6.4 验证结果及评价杂质A、杂质C、杂质D、杂质XA、杂质XB、杂质XC和的检测限依次为0.0002%, 0.0002%, 0.002%, 0.0004%, 0.005%, 0.001%, 它们的定
35、量限依次为0.001%, 0.001%, %, 0.002%, 0.02%, 0.005%,结果表明，方法的灵敏度适合杂质的检测和控制。表6-1 定量限和检测限结果组份最小检测浓度（g/ml）信噪比检测限最小定量浓度（g/ml）信噪比定量限杂质A0.0022.40.0002%0.0111.20.001%杂质C0.0022.50.0002%0.0113.40.001%杂质D0.0162.70.002%杂质XA0.00430.0004%0.01611.80.002%4. 验证评价及结论验证结果表明，方法的专属性、系统适用性试验、精密度、线性及范围、准确性、检测限和定量限均符合验证可接受标准，验证通过。本方法适合于原料药中色谱纯度的测定。5附件：及相关杂质的信息、相关记录、图谱及标准曲线等。
