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1、Chapter13 核酸的物理化学性质,一、核酸的水解,（一）核酸的酸水解或碱水解,核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2或3磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。DNA一般对碱稳定，RNA对碱不稳定。,第1页/共17页,（二）核酸的酶水解,一、核酸的水解,生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶
2、可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3端或5端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。,Chapter13 核酸的物理化学性质,第2页/共17页,Chapter13 核酸的物理化学性质,一、核酸的水解,（二）核酸的酶水解,脱氧核糖核
3、酸酶类1、牛胰脱氧核糖核酸酶(DNaseI)：从5磷酸末端切下寡聚核苷酸。2、牛脾脱氧核糖核酸酶(DNaseII)：从5磷酸末端切下寡聚核苷酸。3、限制性内切酶：存在于细菌体内，用于专一性地降解外源的DNA，限制性内切酶已成为基因工程最重要的工具酶。如 EcoRI（请看教材503504页）,第3页/共17页,二、核酸的分子量、溶解性、粘度和酸碱性质,Chapter13 核酸的物理化学性质,1、分子量在数百至数百万之间；微溶于水，不溶于有机溶剂；变性时粘度降低；2、核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解离。在一定的条件下可形成兼性离子，为两性电解质，具有等电点。,第4页/共17页,Chapter13
4、 核酸的物理化学性质,三、核酸的紫外吸收,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，最大吸收峰波长（max）在260nm处，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。,第5页/共17页,Chapter13 核酸的物理化学性质,三、核酸的紫外吸收,摩尔磷消光系数 508页,增色效应：核酸发生变性时，摩尔磷消光系数 增加的现象。减色效应：复性后，摩尔磷消光系数 又降低的效应。,第6页/共17页,Chapter13 核酸的物理化学性质,四、核酸的变性、复性及分子杂交,(一)核酸的变性(denaturation)核酸的变性:维系核酸三维结构的碱基堆积力和氢键如果受
5、到某些理化因素的破坏，其三维结构就要改变，从而引起理化性质及生物学功能的改变，这种现象称为核酸的变性。变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。,变性与降解的区别：是否涉及共价键的断裂和分子量的改变。,第7页/共17页,第8页/共17页,Chapter13 核酸的物理化学性质,四、核酸的变性、复性及分子杂交,核酸的变性的特征,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将引起DNA变性的温度称为融点，用Tm表示。一般D
6、NA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,影响DNA Tm大小的因素：DNA的均一性；GC的含量；介质中的离子强度。,第9页/共17页,Chapter13 核酸的物理化学性质,四、核酸的变性、复性及分子杂交,当DNA的稀盐溶液加热到80-100时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。DNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收(260 nm)值升高,粘度降低等。,第10页/共17页,Chapter13
7、核酸的物理化学性质,四、核酸的变性、复性及分子杂交,(二)核酸的复性(renaturation)核酸的复性:变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。,第11页/共17页,(二)核酸的复性(renaturation),第12页/共17页,Chapter13
8、 核酸的物理化学性质,四、核酸的变性、复性及分子杂交,(三)核酸的杂交(hybridization)热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构，叫核酸杂交。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。,Southern blotting（Southern印迹法）：DNA-DNA杂交Northern blotting（Northern印迹法）：DNA-RNA杂交Western blotting（Western印迹法）：抗
9、原-抗体结合 510页,第13页/共17页,(三)核酸的杂交,第14页/共17页,五、核酸的沉降特性,Chapter13 核酸的物理化学性质,超速离心法纯化核酸。分离DNA常用氯化铯密度梯度；分离RNA常用蔗糖密度梯度；应用啡啶嗅红-氯化铯密度梯度平衡超离心可将不同构象的DNA、RNA及蛋白质分开，是实验室最常用的纯化质粒DNA的方法请看515页,第15页/共17页,Chapter13 核酸的物理化学性质,六、核酸的凝胶电泳,1、琼脂糖凝胶电泳：分析分子量大于1000bp的DNA片段请看516页,2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：分析分子量小于1000bp的DNA片段,第16页/共17页,七、DNA的固相合成 520页,八、DNA的限制酶图谱,限制性内切酶,来源于细菌，高度专一地识别外源DNA上的特定位点，并将其切断，形成形成粘性末端或平齐末端。不降解自身细胞的DNA。因为在自身相应位点上经甲基化修饰而受到保护。,DNA的限制性内切酶图谱,何叫回文结构？,ATCGATCGATCGATTAGCTAGCTAGCTA,即对某DNA上所有的限制性酶切位点的确定。,本节完,第17页/共17页,
