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1、根系活力的测定 target=blank根系活力的测定(-萘胺氧化法) 与过氧化物酶活性的测定09050321 孙蕾蕾 09050322 余浣莎一、实验目的1、掌握-萘胺法测定根系的活力2、观察重金属胁迫对根系活力的影响3、掌握比色法测定过氧化物酶活性的原理和步骤二、实验原理1、植物根系能氧化-萘胺,可通过测定溶液中未被氧化的-萘胺的量,定量测定根系活力。2、在有过氧化氢情况下过氧化物酶能使愈创木酚氧化生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测OD470的变化来测定活力。三、实验步骤1、取50ug/mL的-萘胺和磷酸缓冲液各25mL,于三角瓶中混匀,须根系洗净吸干,取0.
2、5g浸入三角瓶,同法处理无根系对照组,5min后从两瓶中各取2mL,按步骤3做第一次测定。2、将两三角瓶置于25度恒温瓶避光保存60min后,各取2mL,按3做第二次测定。3、取2mL培养液加10mL水混匀,再依次加入1mL对氨基磺酸与1mL亚硝酸钠,混匀,观察溶液颜色变化,再定容至25mL。室温25min后,于510nm处测定吸光度(OD)值。4、标准曲线的制备：以50ug/mL的-萘胺溶液为母液，配制40、30、10、5、0ug/mL的溶液各10mL。各取2mL，按照步骤3分别反应，并测定OD值。以OD值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制-萘胺溶液的标准曲线，或者根据浓度与OD值关系直接计算回归
3、方程。5、分别查对标准曲线，或利用回归方程直接计算出实验组与对照组溶液实验前后对应的-萘胺溶液浓度。6、提取野菱叶片的酶液。7、现配反应混合物，即50m LpH6.0磷酸液+28ul愈创木酚+19ul H2O2(30)8、取两只比色杯，1只加3mL反应液+0.2mL磷酸缓冲液，调零。另一只加3mL反应液，加0.2mL酶液，立即开始计时，每隔10s读数1次。直至OD4701.00。9、计算酶活性四、实验结果及其分析一1、结果组别/OD值未暗保存过的OD值暗保存过的OD值实验组 0.4290.339对照组 0.5100.529 2、计算：X：根系活力X=(C-C)*V/(Fw*h)=(21.0ug
4、/mL-16.5ug/mL)48mL/0.495g(60min-5min)/60min/h=7.210-4其他各组数据：3.9410-4、1.6310-4、2.4610-4、4.1710-4、1.9610-43、分析由于对照组实验数据出现差错，故舍弃，直接对实验组数据进行分析。本组数据的数量级与其他各组一致，但其值相差较大，分析原因如下：1）、计算方法不一：其他组可能未舍去对照组数值进行数据计算，造成差异；2）、实验材料不一：本组选用的为0ug/mL Cd2+ 的Hogland溶液培育一周的野菱须根，其他各组选选用的为打捞不久的新鲜野菱须根；3）、标曲的转化误差：手工制图的标曲不可避免会出现偏
5、差；4）、溶液量取的误差：本实验多次涉及溶液的量取与定容，容易造成偏差；5）、测OD值的偏差：各组选用的不是同一台分光光度仪，甚至型号不一，分为722与723两种。另外比色皿的清洁度也会造成影响；6）、植物根系能氧化-萘胺，生成红色的-羟基-1-萘胺，并沉淀于有氧化能力的根表面，从而使这部分根染成红色，而有机化学反应较慢且不彻底，跟反应时间长短有很大关系，对照组的OD值是在未暗处理前测得的，可能反应不完全不充分，造成数值小于暗处理一小时后的OD 值。二1、结果：Y：过氧化物酶活性X=A470VT/(WVS0.01t)=(0.777-0.544)7mL/(0.177g0.2mL0.011min)
6、=4607.34 A470：反应时间内OD变化值VT： 提取酶液总体积W： 植物鲜重VS： 测定时取用酶液体积t： 反应时间其他各组数据：4473.37、4201、5511.3、2202.22、5887.85、3086.72、分析1）、实验材料不一：本组选用的为0ug/mL Cd2+ 的Hogland溶液培育一周的野菱叶片，其他各组选用的为打捞不久的新鲜野菱叶片；2）、pH的调配不一： 本实验 pH值应为6，可能存在pH值的差异，有的组是按pH=7配制反应混合液的；3）、叶片酶液的提取程度不一：由于研磨、离心等操作差异，造成酶液的提取程度差异，本组提取的酶液呈现透明的白色，其他各组提取的酶液有
7、呈现明显的绿色。4）、测OD值的偏差：各组选用的不是同一台分光光度仪，甚至型号不一，分为722与723两种。另外比色皿的清洁度也会造成影响；5）、记录OD值变化时，每10s记录一次数值变化，与人眼的反应快慢和选取的时间段数据值有一定关系。五、实验小结通过本次实验的结果分析，我们认识到实验的成功取决于多方面因素：首先从实验的设计开始，就要做好周密的计划，设计的实验在保证其可行性的基础上要有一定的精密性。要做到明确实验目的，掌握实验原理，正确选用仪器及试剂，选择合适的材料，操作时规范有序，对结果及现象进行分析时要做到有凭有据，细心计算，得到好的结果要总结经验，未得到满意的结果要总结教训。例如本组实验对材料的清洗及保存就有较高的要求，清洗不彻底在培育过程中会受到水藻的抑制性竞争，从而影响其生长，造成材料的损伤。在配置溶液时，不仅要考虑其浓度等因素，有时也要注重调节pH值的大小。只有考虑周全，设计合理，准确操作，才能做好每一次实验，获得进步！谢谢老师！
