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1、实验二、根系活力的测定 a-萘胺氧化法,植物生物学实验(二)植物生理学基础与综合实验,南京师范大学生命科学学院,一、实验目的,了解根系活力的生理意义；掌握a-萘胺氧化法 测定根系活力的原理与方法。了解植物生理学实验设计中的一些注意事项。,二、实验原理,（一）植物根系的生理功能:吸收：水分、无机盐、CO2。输导 固着 合成 贮藏,根系吸收无机盐的过程：,部位：根尖，根毛区最活跃。步骤1，呼吸释放CO2；2，形成H2CO3；3，H+与HCO3-吸附在根表面。4，溶液中阴阳离子分别与HCO3-、H+交换。5，吸收，进入根内部。6，运输。,根系活力即根的生长情况和代谢水平。它直接影响植物地上部的生长和
2、营养状况以及产量。植物根系中的过氧化物酶能氧化-萘胺，生成红色的-羟基-1-萘胺，并沉淀于根表面，将根系染成红色。一般来说根呼吸强度越大，即该酶的活力越强，对-萘胺的氧化力也越强，染色也越深。可以根据根系表面着色深浅，定性观察并判断根系活力大小，也可通过测定溶液中未被氧化的-萘胺的量，以定量测定根系活力。,（二）根系活力的意义与测定方法,定性观察,根系表面红色越深，说明根系活力越强。,定量测定,剩余的-萘胺在酸性环境中可与对氨基苯磺酸（sulfanil-amide）和亚硝酸盐作用生成稳定的红色偶氮染料。,定量测定,对-苯磺酸-偶氮-萘胺,生成的红色偶氮化合物在pH 7.0时在510 nm处有最
3、大吸收峰，可用分光光度法测定光吸收值，从而利用此反应来间接测定溶液中-萘胺的量。,注意：,OD510越大-萘胺剩余越多根系活力越弱反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。,三、实验材料与仪器设备,（一）实验材料 水稻(Oryza sativa L.)等水生植物的须根系。（二）仪器与用品 分光光度计、天平、恒温培养箱、三角烧瓶、量筒、移液管、剪刀、玻棒。（三）试剂-萘胺溶液：先用少量的95%酒精溶解，然后加水定容成。配制50 g/mL、50 g/mL溶液。0.1 mol/L磷酸缓冲液，
4、pH 7.0。1%对氨基苯磺酸溶液：溶解于30%的醋酸溶液中。0.01%亚硝酸钠溶液。,四、实验步骤,（一）定性观察：处理：挖取处于不同生长状态的须根系植株（如水稻、豌豆苗根系等）数株，洗净根部后再用滤纸吸去根上附着的水分。,2.观察,将植株根系浸入盛有25 g/mL-萘胺溶液并用黑纸包裹的容器中，静置24-36小时后观察根系着色情况。比较不同植株根系活力大小，并与植物生长势比较，分析植物生长势与根系活力之间的关系。,（二）定量测定,取50 g/mL 的-萘胺溶液和0.1 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液各25 mL，置于三角瓶中，混匀。称取根系2 g浸没于三角瓶中的溶液中。同样地，取50
5、 g/mL的-萘胺溶液和0.1 mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液各25 mL，置于另一三角瓶中，混匀，不放根系作为对照。,1、实验处理,2、实验初始值测定,5min后，分别从两瓶中各取2 mL溶液，按照步骤4作第一次测定。记录OD（实验组）与OD0（对照组）。,3、实验终了值测定,将两三角瓶置于25恒温箱中避光保温60min后，各取2 mL，按照步骤4作第二次测定。记录 OD（实验组）与OD0（对照组）。,4、a-萘胺含量测定,取2 mL培养液加10 mL水混匀，再顺次加入1 mL对氨基苯磺酸溶液与1 mL亚硝酸钠溶液，混匀，观察溶液颜色变化，再定容至25 mL。室温25min后，于510
6、nm处测定吸光度（OD）值。,5标准曲线制作：,以50 g/mL的-萘胺溶液为母液，配置40、30、20、10、5、0 g/mL的溶液各10 mL。各取2 mL，按照步骤4分别反应，并测定OD值。以OD值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制-萘胺溶液的标准曲线。或者根据浓度与OD值关系直接计算回归方程。,6换算浓度,分别查对标准曲线，或利用回归方程直接计算出实验组与对照组溶液实验前后对应的-萘胺浓度（C、C与 C0、C0）。,7计算根系活力,根据实验结果计算不同植株根系对-萘胺的生物氧化强度（mg-萘胺/gFWh），并与植物生长势比较，分析它们之间的关系。-萘胺生物氧化强度=48mL（C-C）-48mL（C0-C0）2g1h,五、思考题,为什么利用a-萘胺氧化法测定植物的根系活力时需要在5min后作第一次测定？测定根系活力时最好选择根的哪个部位？为什么？3.简述分光光度计使用过程及注意事项。,4、在使用分光光度计时，为什么每改变一次波长，就需要重新调零和调透光率100%？5、为什么在测定时需要洗净比色皿？洗净的比色皿在倒入提取液时为什么还要用提取液洗2-3遍？,
