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1、益生元因可增加肠道益生菌的种群数量益生元因可增加肠道益生菌的种群数量，并可有效改善机体健康状态而备受学者的关注。已有大量研究表明非消化性的低聚糖具有良好的益生元作用，且性质稳定、安全无毒。因此开发新型功能性益生元，是益生元研究和工业化发展的重要方向。本文拟以人参多糖益生菌菌株为研究对象，对人参多糖的潜在益生元活性及合生元的功能性进行评价。 利用气相色谱检测了不同菌株发酵液中乳酸和短链脂肪酸的含量，结果表明不同菌株所产生的主要短链脂肪酸均为醋酸，含量由0.55到1.18mg/mL，且菌株C88总短链脂肪酸产量均高于其它菌株。利用DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子自由基清除实验及铁离子螯合
2、实验评价人参多糖与植物乳杆菌C88联合使用的体外抗氧化活性，结果表明人参中性多糖与人参酸性多糖分别与植物乳杆菌C88联合使用均具有明显的抗氧化活性，且酸性多糖活性高于中性多糖。另外，以自然衰老小鼠作为动物模型，通过体内试验检测人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88的体内抗氧化活性，结果表明联合用药可抑制衰老小鼠血清及肝组织中中丙二醛 (MDA) 的形成，提高超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性及总抗氧化能力(T-AOC)。 研究结果表明人参酸性多糖联合益生菌C88可明显增强免疫抑制小鼠吞噬细胞的吞噬能力及迟发型超敏反应结果，小鼠血清白细胞介素-2
3、、白细胞介素-4、干扰素-、肿瘤坏死因子-，免疫球蛋白-g含量明显升高，白细胞介素-10含量明显下降，并且均具有一定的剂量依赖性，同时联合用药组的作用效果要明显强于酸性多糖单独用药组。 称取干燥人参根粉末200g，按1:10比例加入蒸馏水浸泡过夜，100提取两次，每次2小时，合并提取液并过滤，浓缩滤液至800mL，加入3倍量无水乙醇醇沉，过夜。收集沉淀，加尽量少蒸馏水充分溶解，离心，收集上清液，重复3次后，硫酸-苯酚法显色检测基本无多糖，合并上清液，于-80冷冻后干燥，得粗人参多糖(WGP)。 1.2.1.2人参粗多糖分离纯化 称取上述制备的人参总多糖加水溶解，离心，取上清，重复3次，合并上清
4、液，弃沉淀，利用 DEAE-纤维素离子交换层析柱，分别以蒸馏水和0.5MNacl为洗脱剂。上样后，首先以蒸馏水进行洗脱，后以 NaCl 溶液进行洗脱。洗脱液利用自动部分收集器收集，合并含多糖的洗脱液部分，透析2-3天后于-80冷冻干燥，分别得中性多糖(WGPN)及酸性多糖(WGPA)，收集备用。 1.2.2 人参多糖益生元活性评价 1.2.2.1菌株来源及培养基 菌株来源：菌株“C”分离于内蒙古奶豆腐，菌株“S”分离于东北传统发酵酸菜。上述菌株均已通过API50 CHL试剂盒及16S rDNA序列分析鉴定为植物乳杆菌。 配制含人参多糖的SDM培养基时除添加葡萄糖外，其它均同。分别以葡萄糖、人参
5、酸性多糖、人参中性多糖为碳源，配制相同浓度的SDM培养基。 1.2.2.2 人参多糖对植物乳杆菌益生元活性测定 菌株分别用上述培养基进行培养，初步筛选出生长状况相对良好的菌株并测定菌株生长曲线。生长曲线测定方法：无菌操作条件下，将已配制的含不同人参多糖或葡萄糖的SDM培养液分装于无菌10mLEP管中，每管3mL，按3%接菌量，于37培养箱培养，于培养0、4、8、12、16、20小时时测定OD600值。 分别将不同时间段培养液取出后离心得菌泥，加入等体积的生理盐水，充分混匀后，利用紫外-分光光度计于600nm测定OD值，记录不同菌株的生长情况，筛选出菌株生长趋势最为明显的菌株。 1.2.3短链脂
6、肪酸分析测定 短链脂肪酸的测定根据Schneider等59的描述，利用气相色谱进行测定。分别用人参酸性多糖SDM培养基及人参中性多糖SDM培养基培养上述已筛选菌株，每株4ml按3%接菌量，37厌氧培养20h后，取2mL培养液至已灭菌的10mLEP管中，加入0.5mL质量分数为2%的硫酸铜溶液杀死菌株。取2mL上述含硫酸铜的培养液于EP管加入0.4mL质量分数50%的硫酸和2mL乙醚混匀，于摇床250r/min振荡摇匀45min，后离心，取上清液于另一无菌EP管中，加入无水氯化钙脱水，取上清液利用气相色谱测定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸及乳酸的质量浓度。 短链脂肪酸测定采用外标法，用乙酸、丙酸
7、、正丁酸、异戊酸和乳酸做标准曲线，检测器为氢火焰检测器；色谱条件为载气N2，分流比10:1，流速2.0mL/min；用DB-FFAP色谱柱；升温程序：120维持5min，以15/min 升到250保持1min，燃烧炉温280，待测样品体积为2uL。 1.3结果 1.3.1人参多糖的提取及纯化 根据张旭等的31描述方法，利用水提醇沉法从干燥人参根中提取水溶性多糖，通过Sevag法除蛋白后，得到粗多糖，即为水溶性人参粗多糖，其提取率约为8.2%。收集得到的人参总多糖利用DEAE-纤维素离子交换层析住进行分离纯化，以蒸馏水为洗脱剂得到未吸附多糖部分，即中性多糖，以0.5M NaCl为洗脱剂得到吸附多
8、糖部分，即酸性多糖，回收率分别为50.6% 和14.3%。 “益生元”是一种不易被消化的食品成分，通过选择性刺激一种或少数种菌落中的细菌活性与生长而对宿主产生有益的影响，最终改善宿主的健康状态60。 研究报道表明某些低聚糖具有益生元活性，如低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖等61-62 。这些复杂的碳水化合物在小肠内不被消化，在结肠可优先促进双歧杆菌和植物乳杆菌的生长。最为人们所熟知的即为菊糖和低聚果糖，可选择性的刺激双歧杆菌的生长63-65。因为对于益生元需求的日益增加，所以目前对于发现新的具有潜在益生元活性的碳水化合物受到极大关注。进一步的研究重点主要是针对自然资源中所提取的多糖进行益生元活性
9、的探索，如：挪威云杉、金莲花、平菇、杏鲍菇等自然资源中所提取的多糖。人参多糖作为人参中主要的活性成分，许多研究致力于人参多糖的提取，分离，纯化，结构分析及活性研究等，而对其益生元活性的研究报到甚少，本实验主要以人参中提取分离的中性多糖及酸性多糖为碳源培养并筛选生长状态良好的不同来源的植物乳杆菌菌株，同时检测了人参多糖对不同菌株短链脂肪酸产量的影响。 本研究对于人参多糖潜在益生元活性的评价是通过植物乳杆菌对多糖的利用,发酵过程中以其作为主要的碳源进行生长而测定。实验结果表明10株植物乳杆菌在不同的人参多糖中表现出不同的生长特性。这一结果与一些学者所报道的研究结果相一致66。益生菌对不同多糖的降解
10、或发酵能力在不同种的植物乳杆菌或同一种群的不同株植物乳杆菌中具有较大差别67。另外，研究表明人参中性多糖的益生元活性要强于人参酸性多糖。导致这种结果的原因可能是因为人参多糖的结构特征所导致，如：分子量，单糖组成，分子构象等都可能是影响多糖益生元活性的重要因素。 样品配制：分别称取中性人参多糖及酸性人参多糖以蒸馏水为溶剂配制浓度为0、0.5、1、2、4mg/ml的多糖溶液；以维生素C或乙二胺四乙酸作为阳性对照，配制相同浓度的对照溶液；同时培养并制备1010CFU/ml浓度的C88菌液。 实验分组：1 Vc阳性对照组；2 人参酸性多糖组；3人参中性多糖组；4人参酸性多糖联合益生菌C88组； 5人参
11、中性多糖联合益生菌C88组。 2.2.1.1 DPPH自由基清除作用 1.5ml各样品溶液分别加入1.5ml 0.1mmol/L DPPH无水乙醇溶液，混匀，室温避光静置反应30min后离心，取上清液于517nm处测定吸光度值，DPPH自由基清除率计算公式如下： 7mmol的ABTS溶液与2.45mmol的过硫酸钾溶液等体积充分混匀，室温避+光条件下反应16h。使用时ABTS溶液利用乙醇溶解稀释，使得其在734nm处+的吸光度值为0.70.02。分别取不同浓度的样品溶液各0.5ml与2.5ml ABTS溶液充分混匀，室温下反应6min后离心，在734nm处测定吸光度值。去离子水代替样品作对照，
12、乙醇空白，ABTS清除率计算方法如下： 5mL 0.05mol Tirs-HCl缓冲液25水浴20min，再加入2mL样品溶液及0.4mL25mM邻苯三酚溶液，相同温度下培养5min，最后向反应体系中加入 0.5mL HCl终止反应，10min后离心取上清320nm条件下测定吸光度，超氧化物阴离子清除率计算公式如下： 1mL不同浓度的样品溶液分别与0.05mL 2mM的FeCl2溶液充分混匀，静置5min后，分别加入0.2mL 5mM的菲咯嗪及2.75mL的蒸馏水，充分振荡混匀，室温下静置反应10min后离心取上清。于562nm处测定吸光度值。EDTA作为阳性对照。铁离子螯合能力计算方法如下：
13、 衰老雄性昆明小鼠与青年雄性昆明小鼠购于长春高新医学动物实验研究中心。22，昼夜循环各12h条件下饲养，适应性喂养1周，实验期间自由进食进水。 衰老昆明小鼠随机分为5组，每组8只，分别为衰老小鼠对照组，人参多糖联合益生菌C88高剂量组、中剂量组、低剂量组及Vc阳性对照组，实验组灌胃给药，每日一次，连续给药20日。青年昆明小鼠作为正常对照组。衰老小鼠对照组及青年小鼠正常对照组灌胃给予相同体积的生理盐水。最后一次给药24h后称取小鼠体重后脱颈处死小鼠，收集血液样品。解剖分离小鼠脾脏、胸腺及肝脏。称取小鼠脾脏及胸腺湿重，计算胸腺、脾指数，计算公式如下： 末次给药24h后，处死小鼠取血，37放置1h，
14、4放置3h，离心制备血清，-20保存。肝脏制备成10%的冰的生理盐水阻止匀浆，离心，取上清，-20保存。测定血清及肝组织中丙二醛含量、谷胱甘肽过氧化物酶活力、总抗氧化活力活力，超氧化物歧化酶活力、过氧化氢酶活力，采用比色法测定，按试剂盒说明书操作。 2.1.3.3数据分析 采用SPSS17.0 软件利用方差分析完成统计处理。计量数据以xs表示；计量资料组间差异比较采用t检验。差异显著水平为P0.05，极显著水平为P0.01。 2.4体外抗氧化检测结果 2.4.1 DPPH自由基清除作用 DPPH是一种稳定且显紫色的自由基，最大吸收波长在517nm，广泛用于评价抗氧化剂的自由基清除活性，当DPP
15、H与抗氧化剂发生反应时，DPPH转变为无自由基形式的DPPH-H形式，紫色迅速褪去，与其它方法相比较更方便，且敏感度高，可检测较低浓度抗氧化剂的抗氧化活性。图2.1结果表明以Vc作阳性对照，人参中性多糖及人参酸性多糖均呈现不同程度的抗氧化活性，且酸性多糖的DPPH清除活性高于中性多糖的清除活性，且具有剂量依赖性。当两者分别与益生菌C88联合使用时两者DPPH自由基清除作用均明显增强，酸性多糖的浓度4mg/ml与C88联合作用清除率达到最高并与阳性对照Vc活性相当，可达96.7%。 2.4.2 ABTS自由基清除作用 ABTS实验常用于评价植物中某单一物质及混合物的总抗氧化能力。本研究中，多糖样
16、品对ABTS自由基的清除能力如图2.2所示，结果表明，人参酸性多糖及人参中性多糖单独存在时均具有较强的ABTS自由基清除作用，且酸性多糖的清除能力强于中性多糖，且作用强度具有剂量依赖性。当两者分别与益生菌C88联合作用时，清除自由基能力均提高，当人参酸性多糖的浓度在4mg/ml与益生菌共同作用时，清除自由能力与阳性对照Vc相当。 2.4.3超氧阴离子自由基清除能力 超氧阴离子是单线态氧和羟基自由基前体的一种形式，虽然它是一种相对较弱的氧化剂，但其可形成更强的活性氧化物质，诱导脂质、蛋白或DNA的氧化损伤而造成脂质过氧化或细胞损伤，因此超氧阴离子自由基清除作用在抗氧化过程中具有重要作用。多糖联合
17、益生菌的的超氧阴离子清除作用如图2.3所示，结果表明人参酸性多糖及人参中性多糖抗氧化能力不及阳性对照Vc，自由基清除能力随浓度增加强度缓慢增强，当两者分别与益生菌C88共同作用时，清除活性有一定程度的提高，当酸性多糖及中性多糖浓度在4mg/mL与C88联合作用时，自由基清除率分别为45.20%、34.10%。 2.4.5铁离子螯合能力 金属螯合能力可能与抗氧化活性有关，也可能影响与抗氧化活性相关的其它功能。 2.5.1脏器指数 如图2.5所示人参酸性多糖联合益生菌C88对衰老小鼠脏器指数的影响，结果表明衰老小鼠对照组肝脏指数比正常青年小鼠对照组低，并且有显著性差异，人参酸性多糖结合益生菌C88
18、高剂量组肝脏指数高于衰老小鼠对照组，且差异显著(P0.05)。衰老小鼠对照组脾脏指数比正常青年小鼠对照组低，且差异非常显著，人参酸性多糖结合益生菌C88高剂量组脾脏指数高于衰老小鼠对照组，并具有显著性差异。而给药组小鼠肾脏指数及心脏指数与衰老小鼠对照组比较均无明显差异。 总抗氧化活性可以反映非酶抗氧化防御系统的能力。如图2.6所示与青年正常小鼠相比，衰老组小鼠血清及肝组织中总抗氧化能力明显降低，差异非常显著；给药中剂量组与高剂量组小鼠血清及肝组织总抗氧化能力与衰老组小鼠相比明显增强，低剂量组无明显变化。 表2-1表明了人参酸性多糖联合益生菌C88对小鼠血清及肝组织中抗氧化酶活性的影响结果。超氧
19、化物歧化酶属于细胞内抗氧化活性酶，通过超氧阴离子抑制氧化反应的开始。结果表明与正常组小鼠相比，衰老组小鼠血清及肝组织中SOD活性均明显降低，给药中剂量组，高剂量组肝组织SOD有明显增强，给药高剂量组小鼠血清SOD活性与衰老组小鼠相比有明显增强。 谷胱甘肽过氧化物酶活性检测结果表明，与正常组小鼠相比，衰老组小鼠GSH-Px活性明显降低，差异显著，给药高剂量组小鼠血清GSH-Px活性明显增强与衰老组小鼠相比，差异极显著，但其影响作用不及阳性对照Vc。 衰老小鼠组血清及肝组织中过氧化氢酶活性与正常组小鼠相比明显降低，且差异极显著；与衰老小鼠相比，给药中剂量组小鼠肝组织，给药高剂量组小鼠血清及肝组织中
20、CAT活性均明显增强，差异极显著。 丙二醛是判断脂质过氧化的主要指标。本实验丙二醛测定结果如图2.7所示，衰老小鼠血清及肝组织中MDA含量与正常青年小鼠相比明显增加，表明随着年龄的增大丙二醛产量增加，氧化损伤的程度加深，低、中、高剂量给药组小鼠血清及肝组织中MDA含量与衰老组小鼠相比均明显降低。 通过DPPH自由基清除作用，ABTS自由基清除作用，超氧化物阴离子清除作用实验进行检测验证。DPPH自由基因其稳定性已广泛被用于检测抗氧化剂的自由基清除活性实验，而抗氧化剂对DPPH自由基的清除活性又与其本身的供氢能力有关，结果显示人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88对DPPH自由基的清除活性比多糖单独作
21、用时明显增强 ，并且具有剂量依赖性。ABTS自由基清除实验可用于评价混合物的抗氧化活性，在波长734nm处所测定的指标可反应出有机溶剂或水溶剂所提取的多糖的抗氧化活性能力，结果显示人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88对ABTS自由基的清除活性明显强于单独的人参酸性多糖，上述结果表明人参酸性多糖与植物乳杆菌C88之间可能存在协同抗氧化的作用。虽然超氧化物阴离子清除活性及金属离子螯合实验对于检测抗氧化剂的抗氧化活性也具有重要的作用，然而人参多糖联合植物乳杆菌C88对超氧阴离子的清除活性及铁离子螯合能力的协同作用效果并不明显。虽然协同作用的机理尚不清楚，但基于抗氧化活性试验所得到的结果，可以说明人参酸性
22、多糖与植物乳杆菌C88的混合物在抗氧化活性中具有重要的作用。 天然抗氧化酶是重要的防御系统，保护细胞免受氧化损伤。如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶及过氧化氢酶是重要的自由基清除酶，也是机体抵抗氧化代谢产物的二级防御系统。抗氧化酶被认为是防止生物大分子免受氧化损伤的一个主要防御机制。SOD、GSH-Px及CAT是三种重要的抗氧化酶，许多研究表明一种或多种抗氧化酶可缓解衰老的后果。 2.7 小结 上述结果表明人参多糖与植物乳杆菌C88联合用药体内及体外均具有明显的抗氧化活性，体外实验结果表明，联合用药作用效果明显高于多糖单独作用效果，且酸性多糖联合用药组高于中性多糖联合用药组。体内实验进一步证
23、明人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88可明显改善自然衰老小鼠的血清抗氧化指标，增强抗氧化功能，且具有剂量依赖性。由此表明人参多糖联合益生菌C88可作为抗氧化剂且两者可能存在叠加或协同的抗氧化作用，其具体机理需进一步研究证明。SPF级雄性ICR小鼠，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。实验室条件下，20左右，12小时昼/夜循环，自由进食进水，适应性喂养一周。小鼠随机分为六组，每组15只，分别为正常对照组，模型对照组，人参酸性多糖组100mg/kg/d以及人参酸性多糖100mg/kg/d结合益生菌C88 108CFU/mL低剂量组，人参酸性多糖100mg/kg/d结合益生菌C88 109CFU/m
24、L中剂量组，人参酸性多糖100mg/kg/d结合益生菌C88 1010CFU/mL高剂量组。除正常对照组外，其余各组实验动物于实验1-3天腹腔注射环磷酰胺，制造免疫抑制模型。于实验4-21天分别灌胃给予不同剂量的各样品。最后一次给药24h后称重，摘眼球取血，37放置1h，4放置1h，离心制备血清，-20保存。取血后解剖分离胸腺，脾脏，肝脏，肾脏及心脏并称取重量，计算脏器指数。 样品准备：利用优化MRS培养基培养C88菌株 优化MRS培养基配制：果糖 10g，葡萄糖20g，大豆蛋白胨26.7g，酵母浸粉13.3g，柠檬酸钠5g，无水乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐
25、温1mL。量取500mL蒸馏水，倒入烧杯，充分溶解并混匀，115，20min灭菌。 3.2.2脏器指数测定 末次给药24h后，称量小鼠体重，处死后立即摘取心脏、肝脏、脾脏、胸腺和肾脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干后分别称取内脏重量后按下列公式计算脏器指数： 最后一次给药24h后，小鼠称重，尾静脉注射印度墨汁，按0.05mL/10g注射剂量，注射后立即计时，分别于2min及10min时眼静脉丛取血30uL，血液样本与3mL0.1%Na2CO3混匀，600nm测定定吸光度，0.1% Na2CO3作空白，取血完毕后立即处死小鼠，分离肝、脾，吞噬指数计算方法如下： 1% 2,4-二硝基氟苯20mg，将称取药
26、品置于干净小瓶，将预先配好的丙酮橄榄油溶液小鼠右耳两侧均匀涂以DNFB 20uL，丙酮橄榄油溶剂涂于小鼠左耳两侧，于攻击24h后处死小鼠，剪下两耳，称重，以左右耳质量差作为耳肿胀度。 3.2.5生化指标检测 获取血液样本制备血清后，利用ELISA针对性检测试剂盒测定血清中白细胞介素-2，白细胞介素-4，白细胞介素-10，干扰素-，肿瘤坏死因子-，免疫球蛋白-g的活性。 3.2.5数据分析 采用SPSS17.0 软件利用方差分析完成统计处理。计量数据以xs表示；计量资料组间差异比较采用t检验。差异显著水平为P0.05，极显著水平为P0.01。 3.3 检测结果 3.3.1 对免疫抑制小鼠脏器指数
27、的影响 胸腺及脾脏属于非常重要的免疫器官，胸腺及脾脏指数可以指明机体的免疫功能及预后情况。如表3-1所示人参酸性多糖联合益生菌C88对衰老小鼠脏器指数的影响，结果表明模型组小鼠各脏器指数与正常对照组相比均有所降低。人参多糖联合益生菌C88低、中、高剂量组小鼠胸腺指数明显增加，且差异显著，具有一定的剂量依赖性；单独酸性多糖组胸腺指数增加不明显。酸性多糖给药组及不同剂量的联合用药组小鼠与模型组相比脾脏指数均明显增加。人参多糖联合益生菌C88高量组小鼠肾脏指数明显增加。另外，人参多糖联合益生菌给药组小鼠胸腺、脾脏、心脏，肝脏指数均高于多糖单独给药组。表明人参多糖联合益生菌C88可明显改善环磷酰胺诱导
28、的免疫抑制小鼠的免疫器官指数。 利用碳清除实验检测不同样品对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响，结果如图3-1所示，模型组小鼠吞噬指数 k与正常对照组相比均明显下降，且差异显著，表明免疫抑制小鼠造模成功。与模型组相比，人参酸性多糖联合益生菌C88中，高剂量组吞噬指数明显高于模型对照组，且具有剂量依赖性。当高剂量组人参多糖100mg/kg与C88 1010cfu/mL联合用药时，小鼠吞噬细胞吞噬指数可恢复到正常小鼠水平。同时有结果可知，人参多糖联合益生菌共同用药作用结果强于多糖单独用药。因此人参多糖联合益生菌可增强免疫抑制小鼠的吞噬细胞的吞噬能力，达到增强免疫的效果。 2,4-二硝基氟苯所致小数
29、耳廓迟发型超敏反应属于典型的型变态反应模型，是由抗原诱导的一种细胞性免疫应答，作为迟发型超敏反应模型广泛用于药物试验研究中。由图3-2结果可知，模型组小鼠耳肿胀度与正常组小时相比明显下降，表明环磷酰胺降低小鼠迟发型超敏反应的模型成功。与模型组小鼠相比，不同给药组小鼠耳肿胀度均明显增加，且人参多糖联合益生菌C88不同剂量给药组对小鼠耳肿胀度的影响具有剂量依赖性，联合用药中，高剂量组小鼠耳肿胀度均高于多糖单独用药。当高剂量组人参多糖100mg/kg与C88 1010cfu/mL用药时，免疫抑制小鼠迟发型超敏反应结果与正常对照组小鼠相当，耳肿胀度为0.035g。 IL-2 是由活化的T细胞产生，对不
30、同类型的免疫细胞均具有很强的免疫调节作用。IL-4 在免疫球蛋白E的合成中扮演重要的角色，通过激活前辅助 T细胞转化为型辅助细胞，从而触发B细胞中相同类型免疫因子的转化，使免疫球蛋白M或免疫球蛋白G(IgG)转化为免疫球蛋白 E。IL-4 也被证明可抑制干扰素的产生及降低Th1 细胞的分化。白细胞介素-10 是重要的免疫调节细胞因子，通过影响肿瘤坏死因子-的产生而参与到炎症反应的调解过程中。IL-10在感染疾病过程中也发挥着重要作用，例如，流行性脑脊髓膜炎的不断演变演变便与血清中IL-10的浓度有着至关重要关系，如果患者血清中IL-10含量过高会导致病情加重或致命的结果，对于病情轻微或较好预后
31、效果的患者血清IL-10含量较低。IFN-是由活化的T细胞及自然杀伤细胞产生，是I型辅助T细胞( Th1细胞)的重要细胞因子，可激活抗原提呈细胞，通过上调转录因子T-bet而促进Th1细胞的分化。TNF- 是主要是由活化的单核-巨噬细胞所分泌，其次活化的NK细胞，抗原刺激的T细胞以及肥大细胞也可产生，能够使肿瘤发生出血坏死。IgG是生物体液中重要的免疫球蛋白，在抗感染过程中扮演重要的角色。 如图3-3所示模型组小鼠血清IL-2和IL-4与正常对照组相比含量明显下降，IL-10含量明显增加，表明环磷酰胺诱导的免疫抑制模型造模成功。结果可知，人参酸性多糖联合益生菌C88中、高剂量组免疫抑制小鼠血清
32、IL-2含量与模型组小鼠相比明显增加，差异显著。与模型组相比，人参多糖联合益生菌C88中、高剂量组免疫抑制小鼠血清IL-4含量显著增加，且与正常组相当，分别可达43.082pg/mL和45.153pg/mL。人参酸性多糖组及人参酸性多糖联合益生菌C88低、中、高剂量免疫抑制小鼠血清IL-10含量与模型组小鼠相比含量明显降低，且差异极显著，当用药浓度为高剂量，酸性多糖100mg/kg联合C88 1010cfu/mL时，小鼠血清IL-10浓度可恢复至正常小鼠水平，浓度为57.989pg/mL。 人参酸性多糖联合益生菌C88对免疫抑制小鼠血清INF-、TNF-及IgG的影响如表2所示，由结果可知模型
33、组小鼠血清INF-、TNF-及IgG含量与正常组小鼠相比均明显下降，差异极显著。各用药组免疫抑制小鼠血清INF-含量与模型组相比含量明显增加，酸性多糖单独给药组与联合用药低剂量给药组小鼠血清含量增加程度相当，分别为168.180pg/mL和177.250pg/mL，中，高剂量组INF-含量均高于正常组小鼠，且强于多糖单独用药组。 与模型组相比，人参酸性多糖组免疫抑制小鼠血清TNF-含量明显上升差异显著。人参酸性多糖联合益生菌C88低、中、高剂量组小鼠血清TNF-含量与模型组相比差异极显著，高剂量组含量恢复值与正常组相当，含量可达268.657pg/mL。 环磷酰胺作为一种细胞毒性的化疗药物，在
34、肿瘤治疗过程中发挥重要的作用。然而环磷酰胺也可导致机体免疫抑制，危及生命84。 脾脏是重要的免疫器官之一，包含T淋巴细胞、B淋巴细胞以及巨噬细胞，是体液免疫及细胞免疫的中心，脾淋巴细胞增殖反应与T、B淋巴细胞的免疫增强作用相关86。胸腺属于机体重要的淋巴器官，具有重要的免疫功能。胸腺脾脏指数是衡量免疫能力的初步指标，其重量的改变能够初步反应受试样品对机体免疫的调节作用。 机体的免疫反应主要包含特异性免疫及非特异性免疫，单核-巨噬细胞系统是机体非特异性免疫系统的主要组成部分，巨噬细胞属于单核-巨噬细胞系统的重要组成部分，其中最重要的一种非特异性免疫反应是由巨噬细胞所产生，称之为吞噬功能。吞噬作用
35、是免疫防御系统中最后也是最不可或缺的一个步骤，巨噬细胞是免疫系统中的调节和效应细胞，机体血液及组织中的巨噬细胞在抗菌防御机制中扮演着重要的角色，因此增强吞噬功能预期可被用于治疗微生物感染或癌症疾病中87。碳粒廓清实验是一种最常用于检测巨噬细胞吞噬能力的检测方法，通过测定血液中碳粒的消失速度反映巨噬细胞系统吞噬异物的能力，从而评价机体的非特异性免疫功能。Zahra等88人以西伯利亚鲟为实验对象，将不同益生菌单独或分别与益生元阿拉伯低聚木糖联合用药，检测它们的免疫增强作用，结果显示联合用药组作用效果强于单独益生菌用药组，并可明显提高实验动物吞噬细胞的吞噬能力，具有增强机体非特异性免疫功能的作用。本
36、研究采用碳粒廓清实验检测人参多糖联合植物乳杆菌C88对机体单核-巨噬细胞吞噬能力的影响，结果显示人参多糖联合植物乳杆菌C88可显著提高免疫抑制小鼠的吞噬指数，且作用效果明显高于单独人参酸性多糖组，即人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88可提高免疫抑制小鼠巨噬细胞的吞噬能力，从而增强机体的非特异性免疫功能。 迟发型超敏反应由效应T细胞所介导，属于细胞免疫。本研究利用DNFB诱导迟发型超敏反应模型，其原理是机体接触到小分子抗原DNFB后会产生特异性致敏淋巴细胞，当有相应的过敏原接触皮肤后致敏淋巴细胞会释放出多种因子引发以单个核细胞浸润为主的炎症反应。有研究表明多糖可拮抗环磷酰胺导致的DTH的减弱，使小鼠
37、耳肿胀度恢复正常。本研究结果表明人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88可明显增强免疫抑制小鼠迟发型超敏反应，并与正常组小鼠水平相当。因为DTH的发生与效应T细胞、巨噬细胞及其产生的细胞因子或细胞毒性介质有关，所以人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88可能通过增强T细胞向效应细胞转化及增强巨噬细胞的活性来发挥对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠迟发型超敏反应的促进作用。由此证明人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88可增强小鼠的细胞免疫作用。另外，联合用药中、高剂量组作用效果明显高于多糖单独用药组。 细胞因子在免疫系统细胞间沟通中起到重要的作用，可直接或间接的调节免疫反应。大量研究证明伴随抗原的识别，根据所产生的细胞因子的
38、不同成熟T细胞可被诱导分化为三种不同的子集，Th1细胞可分泌IL-2、IL-12、IFN-、TNF- 等，是细胞介导的免疫反应的主体；Th2细胞则可分泌IL-4、IL-5、 IL-6、 IL-10 等，主要介导体液免疫反应89-91；另外， Th1和Th2细胞可分泌的所有细胞因子，Th0细胞均可分泌，被认为是Th1或Th2细胞系分化前的一个阶段，许多研究报道表明植物多糖或乳杆菌可调节细胞因子的产生量92-94。正常情况下，Th1和Th2细胞的功能处于动态平衡状态，从而维持正常的细胞免疫及体液免疫功能。研究结果发现联合用药组作用效果明显高于人参酸性多糖单独用药组，且小鼠血清IL-2、IL-4、I
39、FN-、TNF-含量较环磷酰胺免疫抑制组小鼠明显升高，并具有剂量依赖性。 表明人参多糖联合植物乳杆菌C88可促进免疫细胞的增值及分化，调节Th1/Th2细胞因子的释放从而增强免疫功能。已有类似的报道证明碳水化合物与益生菌联合用药对于增强机体免疫具有更好地作用效果，张等人将枯草芽孢杆菌与低聚果糖为研究对象，分别检测了两者分别单独用药或联合用药对海参免疫功能的影响，证明两者对于增强机体免疫功能方面存在协同作用的效果95。IL-10可扰乱Th1细胞因子的释放，同时影响不用类型免疫细胞的增值及分化96。已有研究表明多糖对于抑制IL-10得分泌起着重要作用97。本试验结果表明人参多糖联合植物乳杆菌C88
40、低、中、高剂量组均可明显降低免疫抑制小鼠血清IL-10的含量，当联合用药为高剂量组人参酸性多糖100mg/kg与C881010cfu/mL时，IL-10含量可恢复至正常小鼠水平，其作用效果明显强于人参酸性多糖单独用药组。IgG，IgA， IgM是主要的免疫球蛋白，参与补体激活、调理作用及毒素的中和等。越来越多的研究表明多糖可通过促进IgG，IgA， IgM的产生来加强体液免疫98。本文研究结果显示人参多糖联合植物乳杆菌C88或人参酸性多糖单独用药组均可明显提高免疫抑制小鼠血清IgG的含量，联合用药中、高剂量组小鼠血清IgG水平可恢复至正常小鼠水平，表明人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88可增强体液
41、免疫。因此通过对免疫抑制小鼠血清免疫指标的检测可知，人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88增强免疫抑制小鼠的细胞免疫和体液免疫。 通过上述研究，选用植物乳杆菌C88与人人多糖联合使用体外评价组合物的抗氧化活性，通过DPPH自由基清除作用、ABTS自由基清除作用、超氧化物阴离子清除作用及铁离子螯合能力测定试验进行检测，结果显示人参中性多糖与人参酸性多糖分别与植物乳杆菌C88联合使用体外均具有抗氧化活性，人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88体外抗氧化活性除铁离子螯合能力外均高于中性多糖联合植物乳杆菌C88；另外，组合用药组抗氧化活性均高于其多糖单独用药组。 以自然衰老小鼠为实验动物模型，体内检测人参酸性多糖
42、联合植物乳杆菌C88的体内抗氧化活性，结果表明人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88抑制衰老小鼠血清及肝组织中中丙二醛 (MDA) 的形成，提高超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性及总抗氧化能力(T-AOC)。 因此人参酸性多糖联合植物乳杆菌对自然衰老小鼠具有明显的抗氧化活性，且具有一定的剂量依赖性。 利用环磷酰胺制造免疫抑制小鼠动物模型，通过吞噬细胞吞噬指数，迟发型超敏反应及对小鼠血清中免疫指标含量的测定，评价人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88的体内免疫调节活性，实验结果显示人参酸性多糖联合植物乳杆菌C88可明显增强免疫抑制小鼠吞噬细胞的吞噬能力及迟发型超敏反应，提高免疫抑制小鼠血清白细胞介素-2、白细胞介素-4、干扰素-、肿瘤坏死因子-，免疫球蛋白-g含量，降低白细胞介素-10含量，并且均具有一定的剂量依赖性，同时联合用药组的作用效果要明显强于酸性多糖单独用药组。 通过上述结论可知人参多糖具有开发成为新型益生元的潜能，并且人参多糖联合植物乳杆菌C88具有明显的抗氧化活性及免疫调节活性，对于开发新型功能性产品具有重要意义。
