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1、FITC记抗体流程其中FITC应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490495nm,最大发射光波长520530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。FITC分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.09.5)条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。 抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。 一,FITC标记抗体流程 将待交联的蛋白对交联反应液透析三次(4 )，至pH9.0。 交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.
2、36g NaCl，加水定容至1 L。 将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/ml。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。 按P:F=1mg:150g 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 反应8 hr。 加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L， 4 终止反应2 hr。 将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。 交联物的鉴定 蛋白浓度(mg/ml) = A280 0.31A495 / 1.4 F/P比例: 3.1A495 / A280 0.31A495 ，该值应介于2.5 6.5之间。 FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐
3、缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4暗处保存。 二,免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法 简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。 操作流程： (1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。 (2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37温育1h，PBS洗33min。 (3)0.01%伊文氏蓝衬染13min，PBS洗33min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。 (4)pH9.0缓冲甘油封片。 (5)镜检 2.间接法 是直接的重要改进，先用标记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结合。 操作流程 : (1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS洗33min。 (2)适当稀释特异性一抗，37孵育1h，或室温4h，或4过夜，PBS洗33min。 (3)荧光标记二抗适当稀释37 30min，PBS洗33min。 (4)0.01%伊文氏蓝衬染13min，PBS洗33min。 (5)封片，镜检。
