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1、几种测定抗菌药物最低抑菌浓度方法几种测定抗菌药物最低抑菌浓度方法 1.1.常量肉汤稀释法 1.1.1.抗菌药物贮存液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于1000g/ml(如1280g/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280g/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750g/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：/1280g/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0m
2、l稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60以下环境，保存期不超过6个月。 1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton肉汤，pH7.27.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%5%溶解马血的MH肉汤。 1.1.4.接种
3、物的制备 有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白肉汤中，35孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含12108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养1824h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种
4、 取无菌试管13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25g/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125g/ml。 1.1.6.孵育 将接种好的稀
5、释管塞好塞子，置35普通空气孵箱中孵育1620h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育2024h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。 1.1.7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。 根据NCCLS推荐的分界点值标准，判断耐药、敏感(susceptible, S
6、)或中介。S表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效，禁忌症除外。R指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度所抑制，或属于具有特定耐药机理，所以临床治疗效果不佳。I是指MIC接近药物的血液或组织液浓度，疗效低于敏感菌。还表示被测菌株可以通过提高剂量被抑制，或在药物生理性浓集的部位被抑制。另外，中介还作为“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控，所导致较大的错误解释。 1.2.微量肉汤稀释法 1.2.1.抗菌药物和培养基制备 同常量肉汤稀释法。 1.2.2.MIC板制备 无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11
7、孔加药液，每孔10l，第12孔不加药作为生长对照，冰冻干燥后密封，-20以下保存备用。 1.2.3.接种物制备 将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH肉汤11000稀释后，向每孔中加100l，密封后置35普通空气孵箱中，孵育1620h判断结果。当试验嗜血杆菌属，链球菌属时，孵育时间为2024h，试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验时孵育时间必须满24h。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125g/ml。 1.2.4.结果判断 以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳
8、性对照孔内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。通常对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的MIC与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个稀释度。 2.琼脂稀释法 琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。 2.1.培养基制备 使用MH琼脂，按
9、商品说明书进行配制，pH7.27.4。淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%绵羊血的MH琼脂。 .2.含药琼脂平板制备 根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在4550水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度34mm。通常按19比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置28冰箱可贮存5天。2 2.3.接种物制备与接种 制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再110稀释，以多点接种器吸取制备好菌液接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为58mm的菌斑。接种好后
10、置35孵育1620h，观察结果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。 2.4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。 如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。 3.E试验 E试验是指浓度梯度琼脂扩散试验，其原理基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料试条中向琼脂中扩散，在试条周围抑
11、菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。E试验综合了稀释法和扩散法的原理和特点，同时还弥补了二者的一些不足，可以像稀释法一样直接定量测出抗菌药物对受试菌的MIC。 3.1.培养基、菌液制备和接种 同纸片扩散法。 3.2.贴E试验条 同纸片扩散法，E试验条的刻度面朝上，不得贴反，一旦接触琼脂后不得再移动。直径150mm的平皿内可放置6根E试验试条，90mm者一般只能放置1根。 3.3.孵育时间和温度 同纸片扩散法。 3.4.结果阅读 孵育后围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈，在抑菌圈和试条的横切相交处试条上的读数刻度即是测定抗菌药物对受试菌的MIC。阅读时应注意的问题见供应商的产品说
12、明书。 目前常用的药敏试验方法如下： 1、定性测定的纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法： WHO推荐的全球统一的标准方法。 原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。 质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。 影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌
13、圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。 2、定量测定的稀释法(dilution test)，主要测定细菌对某药的最低抑菌浓度，包括肉汤稀释法和琼脂稀释法。 琼脂稀释法：原理：将不同剂量的抗菌药物加入融化并冷至50左右的定量MH琼脂中，制成含有不同递减浓度药物的平板。接种待没测菌，35孵育1624h，无细菌生长的最低药物浓度为测试菌的MIC。 本试验特点是可同时做多株菌株的MIC测定，结果的重复性优于肉汤稀释法，且易于发现污染或耐药突变菌，是新药证时常用的外药敏试验经典参照标准。 3、E法(E test)，结合了扩散法和稀释法各自的优点。 是结合了扩散法和稀释法各自
14、的优点，操作简便同扩散法，又可以象稀释法一样直接定量测出抗菌药物对测试菌的最低MIC，结果准确，重复性好，但是价格昂贵。 4、全自动药敏仪法，有Vitek、Microscan、Sensititre ARIS、ATB。 提纯蛋白质后，需要测定其最小抑菌浓度，有文献提到根据MIC测得的结果计算抑菌率： 抑菌率= (阳性对照OD值试验OD值) / (阳性对照OD值阴性对照OD值 )X100 样品的MIC与同性质药物和一些常用药物的MIC进行比较才有意义，不能单纯通过自己样品的结果就判断出高低，并且不能只用一种细菌。要考虑用不同种类的细菌进行实验，还要做质控。根据抑菌率大小可以判断是否具有抑菌能力。
