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1、第二章各种工具酶,内容提要,第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA 连接酶 第三节 DNA聚合酶(聚合酶 I/Taq聚合酶/反转录酶),第一节 限制性核酸内切酶,Restriction endonuclease（RE）一、限制性核酸内切酶的概念二、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的类型四、影响限制性酶活性的因素五、限制性内切酶对DNA的消化,一、概念,1.定义是一类能够识别双链DNA中的特定核苷酸序列，并在特定位点切割双链DNA的内切酶。2.来源细菌的限制性内切酶。,3.功能,(1)限制 Restriction侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），能被限制性内切酶识别和降解，从而保护自身的
2、DNA不被降解。,图 细菌的限制系统,细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识别和水解。Dam甲基化酶在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。Dcm甲基化酶在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入甲基。,(2)修饰 Modification,图 细菌的修饰系统,图 甲基化位点：DNA上的 A/C,二、限制性内切酶的命名,1973年Smith等提出酶的命名原则。用属名的第一个字母和种名的头两个字母，表示宿主菌的物种名。如大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示。用一个大写字母表示菌株或型。如EcoR。同一宿主菌内，如有不同的限制酶，用罗马字母表示。如EcoR I。
3、,限制酶的命名,图 几种重要的限制酶,图 几种限制酶的识别位点,三、限制性内切酶的分类,分为I 型、II型和III型。,1.I 型限制性内切酶,1968年，首先由M.Meselson和R.Yuan在大肠杆菌 B株和 K株分离。如 EcoB和 EcoK。（1）识别序列未甲基化修饰的特异序列：,EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC,（2）切割位点,切点距离识别位点约4007000 bp。不在识别位点。随机切开一条单链。如一条DNA链甲基化，就行使甲基化酶功能，使另一条链甲基化。如两条链已甲基化，酶从DNA链解离。需ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸。,2.III 型限
4、制性内切酶,与I型酶有甲基化功能。能在DNA链上的特异位点切割。其切割位点在识别位点以外。反应需要ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸。基因工程中用途不大。如EcoP15:CAGCAG-,3.II型限制性内切酶,1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox首先从流感嗜血菌中分离出Hind。（1）识别序列与特点双链DNA。未甲基化修饰的靶序列。识别序列长度4 8 bp。多数是回文结构。II s型除外。（2）酶切位点在识别位点处，切开双链DNA，形成粘性末端或平齐末端。,图 类酶识别序列特点：回文序列,(3)平齐末端 blunt end,EcoR V：产生平齐末端。5-GATATC-3 3-C
5、TATAG-5,(4)粘性末端 sticky end,含有几个核苷酸的单链末端。5端突出EcoR I：形成5-粘性末端。5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 3端突出Pst I：形成3-粘性末端。5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5,GAATTC,CTTAA G,G AATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,EcoR I：5端凸出,CTGCAG,GACGTC,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA G,G ACGTC,Pst I：3端凸出,粘性末端的意义,连接方便不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末
6、端容易的多。同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,图 粘性末端连接,5末端标记凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。,四、同裂酶 Isoschizomers,识别位点的序列相同的限制性内切酶。完全同裂酶识别序列相同和切点相同。,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5,不完全同裂酶识别序列相同，但切点不同。,五、同尾酶 Isocaudame
7、rs,1.定义识别序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl、Bcl I等为同尾酶。2.特点同尾酶的粘性末端互相结合后，形成的新位点，不能再被原来的酶所识别。,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl,5-G 3-CCTAG,GATCT-3 A-5,BamH I,Bgl,5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5,BamH I,Bgl,Sau 3A,同尾酶的粘性末端结合形成的新位点不能再被原来的酶识别,六、限制酶的活性,限制性内切酶的识别和酶切活性，只有在最
8、适条件下，才表现出最大酶切能力和位点专一性。1.活性的定义在适当反应条件下，1小时内完全酶解1g特定DNA底物，所需要的限制性内切酶的量，为一个活性单位。,星号活性:改变反应条件，导致限制酶的专一性和切割效率的改变。如EcoR I和BamH I等都有*活性。使用时要防止星号活性。,2.星号活性（*）,在低盐、高pH（8）时可识别和切割,GAATTA、AAATTC、GAGTTC等,5-GAATTC-3,EcoR I：,七、三类限制酶的特性比较,八、影响限制性酶活性的因素,1.DNA的纯度 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。采取措施：纯化DNA 加大酶的用
9、量 延长保温时间 扩大反应体积（20l）,2.DNA的甲基化程度,（1）大肠杆菌有2种甲基化酶修饰质粒：dam甲基化酶：修饰GATC中的A。dcm甲基化酶：修饰CCA/TGG的C。（2）基因工程中使用的是甲基化酶失活突变的菌株。,3.温度 Tm,不同的限制性内切酶，最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。,4.缓冲液 Buffer,缓冲液是影响限制酶活性的重要因素。化学组成：MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度。Tris-HCl：维持pH。二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性。牛血清白蛋白（BSA）：有助于酶的稳定。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,九、限
10、制性内切酶酶切图谱,Restriction mapping1.限制酶对DNA的酶切方法完全酶切/消化对DNA上所有的识别位点都被酶切开。应用有限。部分酶切/消化DNA上只有部分酶切位点被切开。部分酶切的方法：缩短保温时间、降低反应温度、减少酶的用量。,图 完全酶切,如EcoR I（GAATTC）的 4个位点都被切开。,1,2,3,4,1,2,3,4,图 部分酶切,4个EcoR I位点中，仅酶切2个位点。,1,2,3,4,1,4,2.限制性内切酶图谱,（1）定义DNA上某些限制性内切酶酶切位点的图谱，可作为DNA片段的特殊标记。也称DNA物理图谱。,（2）酶切图谱的建立,识别4个核苷酸的内切酶，
11、在DNA链上出现机率为：1/441/256bp识别6个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为：1/46 1/4.1kb识别8个核苷酸的内切酶，在DNA链上出现机率为：1/481/65.5kb,3.限制酶酶切图谱的分析,EcoR1,NotI,EcoRI,NotI,2.0 kb,3.0 kb,1.0 kb,EcoRI,NotI,EcoRI/NotI,3.0kb,5.0 kb,2.0 kb,3.0 kb,5.0 kb,4.0 kb,1.0 kb,4.酶切产物的检测,琼脂糖凝胶电泳法DNA经内切酶酶切，然后在琼脂糖凝胶电泳分析。适合小分子DNA分析。Southern Blot法DNA酶切后，电泳分离。
12、后变性后转移到尼龙膜或硝酸纤维膜，然后与同位素标记的探针杂交，最后做放射自显影，检测多态性条带。,琼脂糖凝胶电泳图谱,第二节 DNA 连接酶 ligase,内容提要一、DNA 连接酶的种类 二、DNA连接的特点三、连接反应的机理四、连接反应的温度五、影响连接反应的因素,一、DNA连接酶的种类,1.大肠杆菌DNA连接酶连接粘性末端。2.T4噬菌体DNA连接酶连接粘性末端。连接齐平末端。,二、连接反应的条件,（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中：NAD+,三、连接反应的机理,1.ATP（NAD+)提供
13、激活的AMP。2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。3.AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。4.AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。5.3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。,四、连接反应的温度,1.最佳温度连接酶反应的最佳温度是37C。2.实用温度但在37下粘性末端的结合很不稳定。所以一般采用 416C。,五、影响连接反应的因素,1.插入片段与载体的浓度比例 1020倍。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。2.反应温度12.5。一般1416。,第三节 DNA聚合酶,
14、内容提要一、常用的DNA聚合酶二、DNA聚合酶的特点三、DNA聚合酶的用途,一、常用的DNA聚合酶,1.大肠杆菌DNA聚合酶 2.Klenow fragment 3.T7 DNA聚合酶 4.T4 DNA聚合酶 5.修饰过的T7 DNA聚合酶 6.逆转录酶,二、DNA聚合酶的特点,1.共同特点把dNTPs连续地加到引物的3-OH端。2.主要区别持续合成能力和外切酶活性不同。T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。,3.DNA聚合酶的特性比较,三、各种DNA聚合酶的用途,1.大肠杆菌DNA聚合酶 I主
15、要用来制备带放射性标记的DNA探针。（1）聚合酶I 的性质一条单链多肽。具备53外切酶活性，位于N端。具备35外切酶活性。具备53的聚合酶活性。用枯草杆菌蛋白酶处理，可以切掉N端的53外切酶活性部分，就成为Klenow fragment。,（2）用DNA聚合酶I 制备探针,核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的、带有标记的寡聚核苷酸。,标记：已知序列的核酸片段,显示位置：与互补的待测序列杂交,标记,已知序列的核酸片断,探针的标记方式,标记,已知序列的核酸片断,带有放射性的已知序列的核酸片断,5,3,DNA聚合酶I 对探针序列的标记放射性同位素标记。A.放射性同位素标记切口
16、转移法(nick translation)：53外切酶活性从DNA切口的下一段DNA的5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3一侧补上一个新的核苷酸。,切口转移法,切口,切口,5,5,3,3,5,3,5,3,1.纯化的DNA片段,2.DNase I 制造单链切口,4.DNA Pol I 进行切口转移,3.一种-32P-dNTP和dNTPs,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,3,32P-dNTP,32P-dNTP,从头至尾都被标记,2.Klenow fragment,（1）Klenow fragment的性质DNA Pol I经枯草杆菌蛋白酶酶切，失
17、去53外切酶活性后的大片段(76KD）。具有53聚合酶活性和35外切酶活性。,（2）主要用途,3端补平补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。,5,5,klenow,klenow,DNA 3末端标记在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。,3隐蔽末端的片段,Klenow片段补平,根据末端的顺序选择一种-32P-dNTPs,末端标记的DNA,限制性内切酶切,5-G3 3-CTTAA5,5-GAA3 3-CTTAA5,5-GAATT3 3-CTTAA5,5-G3 3-CCTAG5,5-GG3 3-CCTAG5,5-GGATC3 3-CCTAG5,EcoR I,BamH I,-32P-dATP,-32P-d
18、GTP,25oC 1h,mRNA,cDNA第一链,逆转录,cDNA第二链,klenow fragment,5,3,3,5,5,3,引物,cDNA第二链的合成,3.T4 DNA聚合酶,（1）T4 DNA聚合酶的性质 来源：从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。酶活性：有53聚合酶活性和35外切酶活性（降解单链更快）。,特点当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。,T4 DNA聚合酶,5,5,3,3,5,5,3,3,T4 DNA聚合酶,无dNTPs,T4 DNA聚合酶,有dNTPs,5,5,
19、（2）T4 DNA聚合酶的用途,补平隐蔽末端 DNA 3末端标记标记末端（取代合成法）方法：用35外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隐蔽端、5隐蔽端）制造出3隐蔽端。再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。,酶切中间产生两个末端标记,加入某种32P-dNTP和dNTPs,T4 35外切酶,DNA酶切片断,T4 53聚合酶,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,内切酶切,无dNTPs,a.放射性标记,优点制作简单、高比放射性、放射自显影效果好。缺点半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、对人体有害、要求在专门实验室操作。,
20、b.非放射性标记,i）生物素（biotin）标记：又称维生素H。结构：CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。也可以被生物素连接酶（biotin ligase）催化与蛋白质共价结合。,纯化的DNA片段,DNaseI制造单链缺口,DNAPolI进行缺口转移,生物素-dTTP和dNTPs,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,3,生物素-dTTP,生物素-dTTP,利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中,光促生物素标记,生物素,连接臂,光敏基因,探针序
21、列,探针序列,生物素,连接臂,光敏基因,+,光照,ii）地高辛标记,可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。地高辛的结合物是抗地高辛抗体。生物素和地高辛标记的探针有试剂盒(kit)。,图 试剂盒(kit),iii）偶联酶及其底物,常用的两种酶：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRPO）碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,AP）酶的作用：催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。,图 化学发光底物,图 HRPO和AP的显色反应底物,HRPO和AP的显色反应底物,发光反应机理,iv）
22、用非放射性标记探针检测原理,探针DNA用生物素或地高辛标记。亲和素或地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个发光或显色反应。亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。,图 非放射性标记探针检测原理,*,生物素,探针序列,待测基因,亲和素,酶,底物,中间产物,产物,发光,核酸探针杂交筛选法的缺点,只检测是否有外源DNA插入，而不论该DNA是否表达出产物。,4.T7 DNA聚合酶,（1）来源从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的。（2）结构由两个亚基组成：T7基因5编码的大亚基：有53聚合酶和35外切酶活性。大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。,（3）T7 DNA聚合酶的特点,持续合
23、成能力强一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。35外切酶活性高单链和双链都能降解。不受DNA二级结构的影响其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍,（3）T7 DNA聚合酶的用途,以大分子量DNA为模板的合成，如M13。进行末端标记取代合成法标记3末端。与T4 DNA聚合酶相同。补平隐蔽末端合成补平3隐蔽末端；水解修平3突出末端。,5.修饰后的T7 DNA聚合酶,（1）T7DNA聚合酶的化学修饰去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途 DNA测序双脱氧法。标记DNA 3隐蔽末端 更有效地补平末端,6.反转录酶：AMV,依赖RNA的DNA聚合
24、酶（RNA指导的DNA聚合酶）。（1）来源RNA肿瘤病毒。普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）。（2）AMV的性质由和两条多肽链组成。,链有反转录活性和 RNaseH活性RNaseH：链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以53或35方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。链RNA-DNA杂交双链中53DNA外切酶活性。,RNaseH,RNaseH,RNA DNA,RNA DNA,（3）逆转录酶的用途,合成cDNA以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。,图 cDNA合成,mRNA,AAAAA,TTTTT,5,3,5,cDNA,合成DNA探针,用随机引物或oligo dT做引物。随机引物（random primer）：随机顺序形成的寡聚DNA片断。（理论上它能与各种序列的模板结合）RT-PCR用的模板克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。,
