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1、生物工程下游分离与纯化,让我们从两个实例说起,实例一 紫杉醇,白色结晶体粉末。无臭，无味。水难溶，溶于氯仿、丙酮。,紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。,1963年美国化学家瓦尼从美国西部大森林 太平洋杉（Pacific Yew）也叫短叶红豆杉树皮和木材分离得到。,从红豆杉中如何获得的呢？,树皮粉碎-85-95%酒精-35-55热回流浸提三次-50-70真空减压浓缩-氯仿萃取-得1%氯仿膏-氯仿完全溶解-硅胶搅拌均匀-干燥-过筛-装层析柱-氯仿-甲醇梯度洗脱-浓缩-得58%半成品-丙酮溶解-硅胶搅拌均匀-干燥-过筛-装层析柱-丙酮石油
2、醚梯度洗脱-浓缩-得2025%半成品-丙酮-石油醚-结晶34次-抽滤-50真空减压干燥-得7580%半成品-16Mpa压力层析分离-浓缩-丙酮石油醚结晶-抽滤-干燥，得995%成品。,严谨而复杂的分离纯化过程！,从杉树中提取，破坏环境、破坏植物多样性、各国明令禁止！,发酵培养1个月,20-25,紫杉醇发酵液,预处理,过滤,滤液,萃取,收集有机物,或纳滤浓缩45减压蒸发,紫杉醇粗提物,大孔吸附树脂脱色提取,80%乙腈洗脱,硅胶柱层析（去除酯、蜡等杂质）,高纯度紫杉醇,正己烷结晶,真空干燥 40,紫杉醇晶体,等体积萃取液 氯仿：甲醇=10:1,内生真菌,冷冻离心,3min,8-12h,严谨而复杂的
3、分离纯化过程！,实例二 血液透析,是急慢性肾功能衰竭患者肾脏替代治疗方式之一。它通过将体内血液引流至体外，经一个由无数根空心纤维组成的透析器中，血液与含机体浓度相似的电解质溶液（透析液）在一根根空心纤维内外，通过弥散/对流进行物质交换，清除体内的代谢废物、维持电解质和酸碱平衡；同时清除体内过多的水分，并将经过净化的血液回输的整个过程称为血液透析。,严谨而复杂的清除代谢废物过程！,从以上两个实例：从复杂的体系中分离纯化出目的 产物或者分离清除出代谢废物的过程至关重要！,生物技术专业还开设一门课称为生物过程下游工艺,生物制品生产过程示意图,本课程解决的问题-下游技术,上游过程,中游技术,发酵液/天
4、然动/植物,预处理,固液分离,细胞破碎,细胞碎片分离,胞外产物,初步纯化,高度纯化,产品及包装加工,均质超声研磨溶胞,沉降过滤离心,粉碎/加热溶解/调pH絮凝或凝聚再凝聚等,离心分离萃 取过 滤,沉 淀吸 附萃 取膜过滤,吸附色谱分配色谱离子交换凝胶色谱亲和色谱液相色谱,无菌过滤超 滤冷冻干燥真空干燥喷雾干燥结 晶,生物分离的一般过程,What?课程基本内容,1.生物工程下游技术的特点和一般流程2.生物样品的预处理（凝聚、絮凝、沉降、过滤、离心）3.膜分离技术(微滤、超滤、纳滤、反渗透、电渗析、透析等）4.色谱分离技术（吸附/分配/离子交换/凝胶/亲和）5.离子交换与吸附（阳离子交换、阴离子交
5、换、吸附分离）6.萃取技术（溶剂/双水相/超临界）7.电泳技术（等电聚焦/毛细管电泳/制备电泳）8.生物样品的精制浓缩结晶干燥,生物工程产品的特点,产物在初始物料中的含量低（氧传递限制；细胞量；产物抑制）初始原料的组成成分复杂（大分子;小分子;可溶物;不可溶物;化 学添加物）；产品中有时含有微生物的细胞、代谢产物、残留培养基；生物活性物质的稳定性差（对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等都十分敏感，易失活变性）；生物发酵产品种类繁多，产物的分子量、结构、性质等往往差异 很大；质量要求高(许多产品用作医药、食品、试剂等)。,生物工程下游分离过程的特点,满足维持生物物质活性的要求满足
6、快速分离的要求满足纯度和杂质去除的要求满足高效分离的要求满足成本优化的要求,生物分离的经济性,(1)生物分离至少占总成本50%(2)降低废物排放（有时甚至产品：废物=1:3250)(3)工艺改造分离工程研发费用与成本研究费用：50%以上产品成本：40-80%人力物力：70-90%因此，生物工程下游技术不可忽视！,生物分离纯化需满足的要求具体化,操作条件必须温和，特别是对具有生物活性的物质，在后处理过 程中必须保持其生物活性；分离纯化技术的选择性和专一性强，能从复杂的混合物中有效地 将目的产物分离出来，达到较高的分离纯化倍数；目的产物的量和活性具有较高的收率；在提高单个分离技术效率的同时，注意各
7、单元操作间的整体协 调，工艺步骤尽可能的少；整个过程快速。,分离纯化路线包括两个基本阶段,产物的初级分离阶段初级分离阶段在细胞培养结束之后，主要是分离细胞和培养液、破碎细胞释放产物（如胞内酶），溶解包涵体，复原蛋白质，浓缩产物和去除大部分杂质等。,产物的纯化精制阶段纯化精制阶段是在初级分离的基础上，用各种高选择性的技术手段，将 目的产物和干扰杂质尽可能地分开，使产物的纯度达到相关的要求。,活性物质分离纯化工艺选择原则,质量原则：保证产品的高质量，一是所选择的分离纯化方法要有利于最大程度的去除杂质。二是在分离纯化过程中要防止生物活性物质的降解失活。收率原则：工艺条件优化时，必须考虑收率的最大化。
8、收率与纯度是一对矛盾体，通过工艺优化研究可以使收率与纯度都达到最佳值。时间原则：一是掌握生物活性物质稳定性的时间；二是工艺路线设计时各单元操作所需时间的匹配，尽量节省时间。,生物分离纯化的基本策略,下游分离纯化工作前的准备：全面的调查分析，充分地论证；准备充足的实验和生产设备提取工艺：尽可能选择简单的提取工艺 分离纯化步骤：原材料的预处理 颗粒性杂质的去除固液分离（离心法、过滤法）可溶性杂质的去除和目标产物的初步纯化（选择性沉淀、膜过滤、选择性吸附以及萃取等技术，去除与目标产物混溶的可溶性杂质；必要时采用集成分离技术）目标产物的精制（如：层析法和电泳法）工艺放大策略：小试中试大规模生产,生物分
9、离技术与化工分离技术的区别,化工分离技术：获得纯的化学物质 生物分离技术：在得到纯的生物物质同时，还必须关注特定杂质的去 除；同时保持其生物活性与传统的化学试剂的纯度概念不同，生物产物对有害物质有严格的控制，生产过程也要求有严格的管理，在最终产品中往往不允许有极微量的有害杂质存在。,生物分离与纯化技术的发展前景技术应用,生物产品的竞争优势最终归结为低成本和高纯度因此，简化工艺、降低成本和提高质量是生物分离与纯化技术的发展方向。1.研究和开发新型和经济高效的分离纯化技术(1)新型分离介质的研制色谱分离介质(2)膜分离技术的推广应用(3)提高分离过程的选择性：应用分子识别原理，利用生物亲和作用的高
10、度特异性，结合已有分离技术：亲和层析、亲和膜分离、双水相萃取、反胶团萃取、亲和沉淀、亲和色谱、亲和电泳等(4)强化分离过程的研究机理研究：综合运用化学、工程、生物、数学、计算等多学科知识和工具，学科交叉，实现新突破2.生物工程上游技术与下游技术相结合3.通过上游工艺条件优化，减少非目的产物eg.半透膜发酵罐；发酵罐中加入吸附树脂总之：进一步研究和开发高效、低成本的分离与纯化技术必将推动生物技术产业的发展,细胞破碎技术,20,研 磨,21,机械法与非机械法比较,例3.超滤膜分离原理示意图（2）,依据被分离物质的体积大小及与膜的亲和性而得到分离,中空纤维超滤膜组件,中空纤维UF膜特点 清洗性好 均
11、匀微孔分布 纤维内径多种规格 膜内部阻力小,卷式反渗透膜组件及不对称膜结构,膜组件,不对称膜,膜分离压力,膜分离技术应用举例,膜分离过程在生物工程中的应用,电渗析分离,透析（Dialysis,D),依浓度差传递低分子量溶质，截留高分子量溶质的过程。,亲和膜分离操作方式,1.亲和超滤过程（分离目标物的同时，浓缩其他成分）,膜孔小,2.微孔亲和过滤过程（仅分离目标物）,例1.凝胶渗透色谱的分离原理,依据被分离物质体积大小不同而分离,例2.离子交换色谱的分离过程,利用被分离物质与离子交换树脂的亲和性不同而得到分离,萃取技术,色谱分离法,色谱系统的基本组成,泵 混合器 层析柱 检测器 记录仪 分部收集
12、器,检测器：吸光度、荧光、折射率、化学发光、电导率等,抗菌素、维生素、氨基酸、酶制剂、酶抑制剂、菌体制剂、免疫活性剂、生物制品、有机试剂、胞外（内）高分子聚合物 等等,霉 菌,放线菌,短杆菌,杆菌,球菌,利用微生物作为菌种发酵生产有用物质,实例1：聚谷氨酸的分离纯化,-聚谷氨酸（-PGA）结构：D-/L-谷氨酸，-酰胺键，1-100万,性质：水溶性、生物相容性、生物可降解性、可食用性、对人类和环境无毒无害,PGA应用领域,药物缓释,保水剂,吸水剂,保湿剂,增稠剂,絮凝剂,-PGA,医药,农业,环境,食品,化妆品,其他,微滤：右侧为外压式中空纤维滤膜，孔径为0.2m，用于除去发酵液中的菌体。超滤
13、：左侧为内压式中空纤维滤膜，透过孔径约为10-100nm。而聚谷氨酸的重均分子量为30万左右，所以通过超滤可以除去发酵液中的小分子蛋白和糖类等杂质；同时实现浓缩。,微滤去除菌体，超滤去除小分子杂质,发酵罐,微滤膜和超滤膜,通过上一步的浓缩过滤，发酵液的体积可以减少数十倍，此时加入四倍体积的无水乙醇，沉淀得到PGA,浓缩液醇沉-离心-透析-冷冻干燥 得到产物,将沉淀离心，利用透析袋进一步除去小分子物质，然后进行冷冻干燥，得到相对纯净的产品。,实例2-凝胶色谱法分离单壁碳纳米管,单壁碳纳米管（SWCNTs）是由碳原子形成的石墨片层卷成的无缝、中空的管体，可包含一层到上百层石墨层。是一种具有战略意义
14、的新兴材料，它在复合材料、平板显示器、生物传感器、抗电磁干扰材料等方面有广阔的应用前景。目前分离单壁碳纳米管的方法：双向电泳、超速离心等主要问题:产量低、费用高多级凝胶色谱法：基于SWCNTs 不同手性结构组分与烯丙基葡聚糖凝胶之间相互作用强度不同而实现分离,预实验研究单壁碳纳米管与色谱填料的相互作用,Figure 1|Effect of overloading single-wall carbon nanotubes(SWCNTs)on gel columns.,请看视频,不同加载量的SWCNT原液及色谱分离效果,（视频说明）2根色谱柱，填充相同量（1.4 ml）的烯丙基葡聚糖填料，柱1、柱
15、2分别加入1 ml和8 ml分散于2 wt%SDS水溶液的SWCNT原液用2 wt%低浓度SDS洗脱非结合的SWCNT，得到2种不同颜色的色谱柱：柱1上紫下蓝；柱2为均匀紫色。再分别注入高浓度（5 wt%）SDS溶液，洗脱掉结合在色谱填料上的SWCNT，柱1为蓝色；柱2为紫色。可见，不同结构的SWCNT可以选择性地吸附在该凝胶色谱填料上，并由于相互作用强度的不同而实现分离。,色谱分离方法与结果,多种不同手性结构组分SWCNT分离原理示意图,分离得到的产物,得到不同组分的吸收光谱,得到的每种组分再重复进行上述凝胶色谱分离过程，便可得到各种不同手性组分和含量的分级产物,重复上述凝胶色谱过程分离得到
16、分级产物,凝胶色谱分离单壁碳纳米管的优点及资料来源,本研究依据不同组分单壁碳纳米管与烯丙基葡聚糖凝胶介质之间的相互作用强度不同，实现产物多组分的分离该方法简单、快速、成本低，易于实现单壁碳纳米管的大规模分离.Ref.Large-scale single-chirality separation of single-wall carbon nanotubes by simple gel chromatography.Nature Communications.2011.5.1-8技术来源于日本筑波 先进工业科学与技术国家研究所（National Institute of Advanced Ind
17、ustrial Science and Technology,Tsukuba,Japan.）,实例3.反胶束萃取技术分离纯化漆酶,What Is Reverse Micelles?,反相乳液,生物来源，生物相容性，无毒无害,What Is RL-based RME?,Rhamnolipid-based Reverse Micelle Extraction,SDS-PAGE Analysis,1-Crude Extract,2-After RME,3-Marker,The Reuse of Reversed Micellar System,该反胶束萃取体系还能反复利用，既减少环境污染，又节省成本
18、。,AOT&Tween-80:synthetic surfactant,反胶束萃取提取漆酶优化条件,1.鼠李糖酯基反相乳液萃取（RL-based RME）能成功用于萃取和纯化漆酶2.RL-based RME比合成型表面活性剂萃取效率更高3.工艺条件对萃取效率产生重要影响4.该体系最佳优化条件：3.3 mM RL,50 mM KCl,pH 5.5,萃取40分钟；反相萃取：250 mM KCl，pH 7.0，萃取时间：40分钟5.SDS-PAGE方法证明鼠李糖酯基反相乳液萃取得到较高的漆酶纯度和收率。,反胶束萃取的优点（1）在反胶束内部包含了水溶液，蛋白质等生物分子萃取后进入反胶团内部的“水池”中，避免了与有机溶剂直接接触，反胶束内的微环境与生物膜内相似，故能很好保持其生物活 性，解决了蛋白质在有机溶剂中容易变性失活和难溶于有机溶剂的问题，为蛋白质的提取 和分离开辟了一条新的途径。（2）成本低，有机溶剂可反复使用；容易放大和实现连续操作（3）反胶束萃取是一条具有工业发展前景的蛋白质分离技术。,过滤,水浸提,粉碎,甜菊叶,滤渣,HZ-818吸附,FeCl3Ca(OH)2,滤渣,滤液,解吸液,过滤,滤液,浸提工段,335脱色,732脱盐,凝聚工段,残液,成品,回收乙醇,喷雾干燥,浓缩,60%乙醇,吸附精制工段,实例4.从甜菊叶中提取 甜菊糖苷的工艺流程图（浓缩：减压旋蒸）,
