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1、病毒类生物制品安全检验和效力检验,序言,“安全、有效、稳定、均一”是兽用生物制品质量概念的4个核心要素，对于生物制品而言,安全和效力检验是所有预防用生物制品的必检项目，也是生物制品企业质量管理和检验人员最主要的日常工作。严格规范的试验操作是取得真实准确的检验结果，保证制品质量的前题。以下就病毒类制品的安全和效力检验问题与大家进行交流。,一、常见病毒类制品的安全检验,安全检验的原理及技术依据安全检验的一般要求安全检验的一般判定原则病毒类制品安全检验的种类和控制要点影响安全检验结果的主要因素安全检验注意事项安全检验的安全措施,安全检验的原理及技术依据,对人、畜及环境安全是对各类兽用生物制品最基本的
2、要求，安全检验的原理就是生物制品大部分是用活的微生物制备而成，有些微生物本身就是强毒或残余一定毒力;另外在制品生产过程中也可能由原材料、设备或操作过程造成外源毒素或微生物污染，如果没有严格的控制手段和检验标准有可能对人畜和环境造成危害。因此兽用生物制品质量标准规定：对于预防、治疗用途的兽用生物制品必须进行安全检验。兽用生物制品安全检验的技术依据如下：1、中华人民共和国兽药典、兽用生物制品质量标准、生物制品规程 2、企业的内控标准 3、企业安全检验SOP,安全检验的一般要求,1、安检样品：除另有规定外，每批抽3瓶混和后按照规定进行检验和判定；2、场地：安全检验应在专用动物舍内进行，不得在野外进行
3、3、安检动物：安检动物必须符合各制品质量标准和规程的要求4、安检动物的饲养：安检动物应单独饲养不得与效检免疫动物及攻毒动物同舍饲养，以免影响检验结果5、特殊规定：凡生产口蹄疫疫苗的企业，对其生产的猪用活疫苗均需增加乳鼠进行安检。凡使用猪瘟强毒或污染猪瘟强毒的生物制品企业，对其所生产的猪用活疫苗均需用无猪瘟抗体的敏感猪进行安检。(避免交叉感染、散毒),安全检验的一般判定原则,安检动物在检验期间如有死亡时，必须及时解剖，明确原因，确属意外死亡时，作无结果论；如检验结果可疑，难以判定时，应以加倍的该种动物重检；如不安全，则该批制品应于报废。凡规定用多种动物进行安检的制品，只要有一种动物的安检结果不符
4、合规定，即不得出售。,病毒类制品安全检验的种类和要点,1、用本动物进行安全检验 用制品的靶动物进行安全检验是最直接最有效的安全检验方法，也是大部分兽用生物制品采用的方法。在用本动物进行安全检验时必须注意以下问题：（1）对于禽用疫苗:a.检验用鸡必须采用SPF鸡，检验用鸡胚必须采用SPF鸡胚，其优点是不需测定有关抗体。b.对于某些标准暂时规定采用易感禽的，在试验前应测定针对被检制品抗原的特异性抗体水平，抗体效价必须符合规定的标准。在接种疫苗以后，必须及时进行观察，特别是对于发病病程短，不以死亡作为判定标准的制品（如法氏囊、传支等疫苗）标准规定必须解剖的制品，必须在规定的时间内进行解剖和判定，需要
5、进行传代的，应采集病料按规定进行传代。（2）对于哺乳类动物疫苗，在接种前应测定针对被检制品抗原的特异性抗体水平，抗体效价必须符合规定的标准。a.在接种疫苗以后，如规定某些观察和测定指标的（如体温、局部反应、肌体状态、食欲变化等），必须按规定全面测定和观察，并及时详细记录。b.对于某些规定的特殊判定标准（如羊痘活疫苗，需测定痘肿反应大小），应及时准确测量并记录具体数据。,2、用实验动物进行安全检验,有的制品标准规定可以用试验动物进行安全检验如牛瘟活疫苗（用小白鼠和豚鼠进行检验）伪狂犬灭活疫苗（用家兔进行检验）这种检验方法较少采用，其特点是试验动物比本动物更为易感，而且试验动物均可表现出特异性的临
6、床症状。对于该类试验观察要点是特异性的临床症状,3、用本动物和实验动物同时进行安全检验,用本动物和试验动物同时进行安全试验，是大多数哺乳类动物用疫苗及多联疫苗采用的方法。在这种安全试验中：a.小实验动物一般承担非特异性的安全评价指标（内毒素、佐剂安全性等）;b.本动物承担特异性安全评价指标;对于这种安全检验，除个别产品的特殊规定外，一般判定原则是:所有试验均应符合规定，只要有一种试验不安全，均判为产品不安全。,4、特殊的安全检验指标,有一些产品，因靶病毒对不同年龄的动物致病性不同，可能规定需用不同年龄段的本动物进行安全检验（如孕畜、仔畜等），对于这类制品应按规定进行检验。,影响安全检验结果的主
7、要因素,对于病毒类制品来说，由于病毒与细菌不同：a.病毒更易受抗体及各种理化因素的影响；b.病毒类疫苗在生产过程中除易受细菌污染外，更易受外源病毒污染，因此潜在的不安全因素更为复杂，因此在对病毒类疫苗特别是弱毒活疫苗进行检验时应注意以下几点：（1）接种动物前及接种过程中应注意对稀释样品进行冷藏，防止病毒灭活及被细菌污染。（2）必须确保试验动物的抗体水平符合规定（3）试验动物的年龄、品种甚至性别必须符合规定（4）某些非致死性病毒病病程较短，症状不典型，应及时全面观察，需要解剖的应及时解剖，防止因观察不及时造成不安全产品的放行。,安全检验注意事项,1.为保证检验的公正性，避免在对安全检验结果判定的
8、主观影响，因此应由2名检验员共同进行。2.为防止污染，涉及疫苗稀释等操作步骤，应当在无菌条件下进行。3.动物饲养环境要符合动物饲养和检验的要求，如果环境因素不稳定，应当设置合适数量的同来源动物对照。4.检验过程中，如出现发病时，要增加观察次数，对死亡动物要及时进行解剖并进行无害化处理,安全检验的安全措施,1、检验过程中应注意防止对检验人员和环境的污染，检验人员必须穿戴工作服、口罩及相关的安全防护器具，撒在操作台、地面的产品要及时进行原位消毒。2、检验完毕后开封的产品均要进行高压灭菌处理。3、发病或死亡动物、粪便及其污染物必须严格按照“防止散毒”等相关规定处理。4、怀孕或手部有外伤的检验人员禁止
9、解剖死亡动物。5、在检验过程中发生烈性传染病或人员意外时，必须迅速报告有关部门采取紧急措施。,二、病毒类制品的效力检验,效力检验的原理及依据效力检验的一般要求效力检验的一般判定原则病毒类制品效力检验的种类及质量控制要点影响效力检验结果的主要因素效力检验注意事项效力检验的安全措施,效力检验的原理及技术依据,对于兽用预防和治疗类生物制品来说，效力是制品的核心质量要素之一，效力是制品中发挥主要作用的核心成分如抗原、抗体及佐剂等效能的集中反映，效力检验是对以上各成分效能的综合指标进行检验，是制品放行前最主要的评价指标，因此兽用生物制品质量标准和规程规定预防和治疗用生物制品必须进行效力检验，影响制品效力
10、的主要因素有抗原的免疫原性、有效抗原的含量、佐剂的效能等，在现有的效力检验方法中，免疫攻毒试验是对以上各因素进行综合评价的最有效的直接方法，而抗原含量测定、免疫动物后的抗体效价测定等均属于间接方法，但由于其指标与免疫攻毒保护试验具有一定的平行关系因此可作为某些制品的效力检验指标。从生物制品的发展趋势来看，由于人们对动物保护、环境和生物安全的重视，这些间接方法特别是体外评价方法是最主要的发展方向。效力检验的技术依据如下：1、中华人民共和国兽药典、兽用生物制品质量标准、生物制品规程 2、企业的内控标准 3、企业效力检验SOP,效力检验的一般要求,样品要求：a.除另有规定外一般每批疫苗任抽1瓶按规定
11、进行检验；b.同批疫苗分为几个亚批时，效力检验均应按亚批分别抽样分别检验，不能采用检验一个亚批代表其它批或几个亚批混和效检的方法进行检验。动物要求：a.应选用同品种、体重大致相同并符合实验动物要求的健康易感动物；b.外购动物要求来源相同,免疫前应隔离观察适当时间，确证符合试验动物标准要求后方可使用。c.隔离舍内饲养。接种要求：a.免疫动物和对照动物必须同时注射;b.强毒不能与免疫接种部位在同一个部位,例如左后腿接种疫苗，攻毒部位应选右后腿。,效力检验的一般判定原则,1、免疫动物中途有意外死亡或损失，如存活头数仍能达到要求的保护头数以上时，可以进行攻毒，攻毒后如能达到标准规定的保护头数，可判为合
12、格。达不到保护头数判为不合格，不得以保护百分率作为判定依据。攻毒后不合格，应算为一次检验。2、对不规律的效检结果如本动物效检不合格，小动物检验合格，应判为不合格。3、同时做两个稀释度检验时，高稀释度（如万倍）合格，低稀释度（如5000倍）不合格，判为无结果。4、攻毒对照动物死亡或发病头数达不到规定要求，但免疫组动物符合标准时，该次检验判为无结果，不计算在检验次数内，但必须签在批签发报表中。对照动物不发病死亡时，不得重复攻毒。5、重检规定：a.规定用本动物检验的制品，效检两次不合格，应报废，不得进行第3次检验。b.规定用本动物或小动物进行效检的制品，可用小动物检2次，本动物检1次，如本动物检验不
13、合格，不得再用小动物进行重检。,病毒类制品效力检验的种类及质量控制要点,病毒类制品的效力检验种类：1、按照检验形式分为：体内试验和体外试验2类，2、根据检验内容分为：攻毒保护试验、抗原含量测定、免疫抗体测定3类。对于弱毒类活疫苗多采用抗原含量测定 对于灭活疫苗多采用攻毒保护试验 以下按照第二种分类方式介绍3类效力检验方法的质量控制要点,（1）攻毒保护试验,攻毒保护试验原理：使用疫苗进行接种的最终目的是使接种过的动物获得抵抗强毒病原感染的能力。因此，对靶动物或已经建立的实验动物模型进行接种后，用强毒病原进行人工攻毒，根据动物的保护情况判断疫苗的效力，是用以检验疫苗效力的最直观方法。攻毒保护试验种
14、类：由于效力检验采用的检验动物均为小样本，一般不以保护百分率表示试验结果，按照结果表示方法分为：绝对保护比例、相对保护比率、半数保护量（PD50）、保护指数（PI值）4种方法。,a.绝对保护比例方法：主要用于采用致死性强毒进行攻击的产品或发病症状特异、判定客观（如新城疫灭活疫苗）等产品，要求对照动物全部发病死亡，免疫动物以攻毒后的绝对保护数为判定标准。（免疫7/10、对照0/5）b.相对保护比率方法：主要用于攻毒毒株毒力较弱，不一定全部发病死亡的制品，如传染性支气管炎（免疫6/8、对照0/4或免疫8/8对照3/4）、兔瘟灭活疫苗（免疫4/4、对照3/4）c.半数保护量（PD50）和保护指数（P
15、I值）半数保护量测定方法:是以不同剂量疫苗免疫动物，采用定量强毒进行攻击，通过计算可使50%动物得到保护的疫苗免疫剂量评价制品的效力，该方法是攻毒保护试验的定量方法，是目前为止较为科学的一种方法。目前采用该方法的产品主要有口蹄疫灭活疫苗、鸡传染性鼻炎、新城疫二联灭活疫苗等。保护指数方法:在国内使用不普遍，主要用于致病力较弱，评价指标不十分客观的制品，如马立克活疫苗的攻毒保护试验等，通过计算免疫组和对照组保护百分比的比值进行效力评价。狂犬病灭活疫苗的攻毒保护试验，通过同时计算疫苗和参考疫苗的PD50，公式为：（疫苗的PD50/参考疫苗的PD50）参考疫苗的IU值，每头份应2IU。,攻毒保护试验的
16、质量控制要点,1、动物：必须是易感动物，在免疫前除SPF动物外，应按要求测定抗体效价。2、免疫：免疫接种量应准确3、攻击用强毒：攻毒前应准确测定毒价，在接种过程中应注意对稀释毒液进行低温保存。4、试验观察：攻毒后应及时观察，有剖检要求的应在规定时间进行剖检观察，要求分离病毒的应及时无菌采集病料。5、记录：应按效力检验SOP及时详细记录规定项目,采用此方法的主要产品有：鸡新城疫灭活疫苗、鸡传染性鼻炎-鸡新城疫二联灭活疫苗、伪狂犬病灭活疫苗、兔病毒性出血症灭活疫苗、猪口蹄疫O型灭活疫苗、牛口蹄疫O型灭活疫苗、猪瘟活疫苗(I)、猪瘟活疫苗（II）、鸡传染性喉气管炎活疫苗、鸡传染性法氏囊病中等毒力株活
17、疫苗、猪瘟、猪丹毒、猪多杀性巴氏杆菌三联活疫苗、伪狂犬活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗、鸡新城疫中等毒力活疫苗、鸡新城疫低毒力活疫苗、鸡新城疫-鸡传染性支气管炎二联活疫苗、鸭瘟活疫苗。注：红色字体疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。,攻毒保护试验效检方法举例,牛口蹄疫O型灭活疫苗效力检验：用至少6月龄的健康易感牛（细胞中和抗体滴度1：8，或乳鼠中和抗体滴度1：4）15头，分为3组，每组5头，将待检疫苗分为1头份、1/3头份、1/9头份3个剂量组，每一剂量组分别于颈部肌肉注射5头牛。接种21天后，连同条件相同的对照牛2头，每头牛舌上表面两侧分两点皮内注射牛口蹄疫O型病毒强毒，每点0.1ml（共
18、0.2ml，含10000ID50）。连续观察10日。对照牛应至少3蹄出现水泡或溃疡。免疫牛仅在舌面出现水泡或溃疡，而其他部位无病变时判为保护，除舌面以外任一部位出现典型口蹄疫水泡或溃疡判为不保护。根据免疫牛的保护数，按Reed-Muench法计算被检疫苗的PD50，每头份疫苗应至少含3 PD50。,（2）抗原含量测定,抗原含量测定原理：制品中的抗原含量与免疫效力一般呈平行关系，因此通过测定制品中的有效抗原含量可间接反映制品的效力。测定抗原含量的方法分为体内和体外两类：a.对于病毒活疫苗主要是测定病毒含量，方法主要有:动物、鸡胚、细胞、血凝试验等。其中采用动物和鸡胚方法属于体内试验；采用细胞和血
19、凝试验为体外试验。结果表示主要有LD5O、TCID50、ELD50、PD50、EID5O）或蚀班数（PFU）、HA价等b.对于灭活疫苗的抗原含量测定，体内试验主要是PD50方法，体外试验主要是一些血清学方法如ELISA等。,病毒含量测定,病毒含量测定方法：每批疫苗按瓶签注明的头份用指定的稀释液作适当稀释后，通常选择三个最佳稀释度，按规定的途径和剂量接种一定数目指定的实验动物、细胞、鸡胚，在规定的时间内观察，根据动物反应、细胞病变、鸡胚存活数或病变数，通过计算LD5O、TCID50、ELD50、PD50、EID5O或蚀班数（PFU），以此来判定疫苗的效力。,病毒含量测定常见疫苗（12种）：口蹄疫
20、O、A型活疫苗、山羊活疫苗、鸡传染性喉气管炎活疫苗、鸡传染性法氏囊病中等毒力株活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗、鸡新城疫中等毒力活疫苗、鸡新城疫低毒力活疫苗、鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗、鸡痘活疫苗（）、小鹅瘟活疫苗、鸡马立克氏病活疫苗、鸡马力克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗。注：红色字体疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。,病毒含量测定方法举例,口蹄疫O、A型活疫苗单价苗的效力检验：将疫苗用PBS做10倍系列稀释，O型苗以10-5、10-6、10-7三个个稀释度，A型苗以10-6、10-7、10-83个稀释度，各皮下接种34日龄乳鼠4只，每只0.1ml，观察4-5日，根据乳鼠发病死亡数计算
21、LD50，每0.1ml O型苗105.5 LD50，A型苗106.5LD50，判为合格。山羊痘活疫苗效力检验方法之一：按瓶签注明头份，用生理盐水稀释测其毒价，每头份病毒含量应103.5 TCID50。,（3）免疫抗体测定,免疫抗体测定的原理：主要是采用血清学试验测定疫苗免疫动物后产生的保护性抗体效价，间接反映制品的效力。病毒性产品主要有病毒中和试验、HI试验、ELISA等，其中中和试验有体内和体外试验两种。HI试验、ELISA均属于体外试验。,病毒中和试验,病毒中和试验有固定病毒稀释血清、固定血清稀释病毒两种方法a.固定病毒稀释血清法以中和抗体效价表示结果，中和抗体效价指能使50%指示动物（鸡
22、胚、细胞）得到保护的抗体稀释度b.固定血清稀释病毒以中和指数表示结果 中和指数指试验组LD50（LD5O、TCID50、ELD50、PD50、EID5O）与对照组LD50（LD5O、TCID50、ELD50、PD50、EID5O）的比值,采用抗体效价测定的常见制品,主要有鸡产蛋下降综合征灭活疫苗（HI抗体测定）、马传染性贫血活疫苗（补体结合试验和琼脂扩散试验）法氏囊疫苗（中和抗体）。禽流感灭活疫苗等。鸡新城疫-鸡传染性支气管炎二联活疫苗、小鹅瘟活疫苗、伪狂犬病灭活疫苗。注：红色字体疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。,抗体效价测定方法举例,鸡产蛋下降综合症效力检验：用3-6周龄的健康易感鸡
23、（HI抗体1：4）10只，每只肌肉或皮下注射疫苗0.5ml,另取10只鸡饲养不免疫；3-5周后采血，测定HI抗体，免疫鸡HI抗体几何平均滴度1：128，对照鸡抗体HI抗体效价应1：4。小鹅瘟活疫苗效力检验方法之一；取健康成年鹅4只，分别采血1ml,分离血清并混合备用。然后注射1个使用剂量的疫苗，每只鹅1ml，21-28日后采血，分离血清混合，将接种疫苗前后的2次血清分别与小鹅瘟GD株在鸭胚中作中和试验。两次ELD50值之差2对数值为合格。,其他效力检验方法,热型反应和发病观察：某些疫苗以适当剂量及途径接种实验动物（本动物、鸡胚）后，可产生典型的热型反应或特征症状及病理变化，借以判定疫苗的效力。
24、主要产品如下：山羊活疫苗、绵羊痘活疫苗、牛瘟活疫苗（）、牛瘟活疫苗（）、猪瘟活疫苗(I)、猪瘟活疫苗（II）、鸡痘活疫苗（）、鸡痘活疫苗（）。注：红色字体疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。,方法举例：,牛瘟活疫苗效力检验：按瓶签注明头份，用生理盐水稀释为1ml含0.01个使用剂量，耳静脉注射1.5-2kg家兔4只，每只1ml。应出现典型牛瘟兔化弱毒的临床反应和病理变化。（症状：体温升高，食欲减退，呼吸急迫，鼻分泌物增多，精神不佳，怀孕后期母兔，间或流产；感染后3-14日可有死亡，内脏可见明显病理变化。山羊痘效力检验方法之一：用羊检验：按瓶签按瓶签注明头份用生理盐水稀释成每0.5ml含2个使用剂量，胸腹部皮内接种山羊3只,每只2粒,每粒0.5ml,观察15日。在接种后5-7日应至少有2只羊出现直径为0.53cm微红色或无色痘肿反应,持续4日以上,逐渐消退。发痘羊间或可有轻度体温反应,但精神食欲应正常。,三、批签发报表中安全和效力检验项的常见问题,1、套用标准术语：有些报表在签写安全检验数据时未签写具体检验数据，而是套用检验标准的数据，如羊痘安全检验结果写为“痘肿直径0.5-4cm”活疫苗病毒含量测定表示为“105.5EID50”2、套用数据：有的连续几批产品EID50、LD50数据完全相同 3、套用表格：口蹄疫灭活疫苗追踪报表连续几批疫苗的效力检验发病牛记录完全相同,谢谢,
